实验9植物染色体标本制备与核型分析1.掌握植物根、茎尖染色体制片技术，获得其染色体标本；2.2.观察各分裂时期染色体形态,测量典型染色体长臂和短臂第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备一、实验目的一、实验目的3.3.了解植物染色体核型分析约定标准及关键技术。 力争通过该实验能让我们自主进行新资源植物染色体核型分析。如张伏安、谷南平等多位师兄用该技术分别完成了鱼腥草、白花败酱、五叶风藤核型分析；其论文发表在本院学报和中国野生植物资源上，也载入了他们的毕业论文。二、实验原理二、实验原理第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备1、预处理原理 8-羟基喹啉处理植物根茎尖分生组织中分裂细胞能达到3个效果。障障碍碍纺纺锤锤体体形形成成降低细胞质粘度促进染色体缩短二、实验原理二、实验原理第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备2、去壁保真原理 纤维素酶和果胶酶降解细胞壁，既能使染色体分散到细胞膜外，且少受机械损伤，从而使染色体图象清晰逼真. 二、实验原理二、实验原理第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备3、着色观察原理 姬母萨是伊红、天青色素和次甲蓝组成的复合染料。伊红是酸性染料，能与蛋白质带正电荷的氨基结合呈红色；次甲蓝是碱性染料，能与蛋白质带负电荷的羧基结合呈蓝色。包装染色体的蛋白质有大量的氨基和羧基，通过静电引力能与GiemsaGiemsa有色基团结合着色。 因着丝粒和次缢痕蛋白质包装量比较少。请问他们的着色程度比染色体臂应该是深些还是浅些？主缢痕主缢痕二、实验原理二、实验原理第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备4、核型分析原理 因着丝粒在染色体上的位置差异导致了各染色体形态差异。Denver将将人体染色体划分成四大类型 请问：DenverDenver划分如下4类染色体的臂比临界值标准是多少？三 实验器具及试剂第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备1、显微镜 请注重显微镜使用登记和保养。2、培养箱 注意显示温度校正和使用登记显微数码互动室( (一一) )实验器具实验器具三 实验器具及试剂第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备1、氯化钾分子量为，配制浓度1000ml，称 KCI=KCI=？（，？（，少许鲜蒸馏水溶解，定溶1000ml1000ml）( (二二) )实验试剂实验试剂2 2、 8-8-羟基喹啉，分子量 8-8-羟基喹啉，少许乙醇溶解，鲜蒸馏水定溶1000ml1000ml3 3、45%45%醋酸：量取45ml45ml冰醋酸定溶100ml100ml4 4、0.25%0.25%纤维素酶和果胶酶酶解混合液 纤维素酶、果胶酶各1g,1g, 鲜蒸馏水分别溶解,定溶20ml,20ml, 再等量混合即可。5 5、甲醇固定：甲醇：冰乙酸=3=3：1 1，鲜配鲜用6 6、姬姆萨母液 姬姆萨与甘油250ml250ml研磨1515分钟，6060水浴2 2小时，加6060预热甲醇250m1250m1，混匀、过滤，棕色瓶室温长期保存。7、磷酸缓冲液：称NaNa2 2HPOHPO4 4 ，少许鲜蒸馏水溶解后，定溶500ml500ml ；称KHKH2 2POPO4 4 ，少许鲜蒸馏水溶解后，定溶500ml500ml ，等量混合。四四 实验材料实验材料 第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备1、绿豆根尖2n=22=82n=22=8m+3smm+3sm2525浸浸种种4-5h4-5h发芽发芽16-16-24h24h；绿豆茎尖染色体2、某植物茎尖学生自拟前人还没有研究的新资源植物种，自采其茎尖五五 实验方法与步骤实验方法与步骤1 1正确取材正确取材第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备根尖 能见根冠(根冠识别)。 2 2次3 3刀取材。预处理时切第1 1、2 2刀取近根冠1cm1cm根段；酶解前第3 3刀取近根冠1-1-2mm2mm根段。2mm8mm123色较深色较深五五 实验方法与步骤实验方法与步骤1 1正确取材正确取材第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备茎尖或叶芽 能见生长锥。2 2次2 2段取材。预处理采顶端2cm2cm茎段，精心剥除多层叶片或幼叶，剥到能见生长锥(3类材料剥生长锥练习)。酶处理时取生长点1-2mm1-2mm茎段。2 2、预处理、预处理 五五 实验方法与步骤实验方法与步骤第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备药剂 0.002mol/L 8-羟基喹啉方法 浸没全部材料； 25处理2小时。3 3、前低渗、前低渗 第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备方法用0.075mol/L KCI冲洗3次 浸没全部材料25下处理30-60min。 作用促进质壁分离，利于去壁。降低细胞质粘度。五五 实验方法与步骤实验方法与步骤4 4、酶解去壁、酶解去壁 第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备五五 实验方法与步骤实验方法与步骤方法第二次取材,放入瓷板孔内；加2.5% %混合酶浸没全部材料26下处理45h；以一触即破为度。注意事项 处理过程中防止酶液干燥。5 5、后低渗、后低渗 第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备五五 实验方法与步骤实验方法与步骤方法酶液回收:用平口吸管,排气后直插孔底,缓慢吸酶鲜蒸馏水清洗3次后；浸没全部材料，处理30 min。 注意事项 酶解过度时不宜冲洗。作用细胞吸水膨胀使染色体分散膜外；降低胞质浓度，清洁染色体标本。6 6、固定、固定 第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备方法吸干瓷板孔内蒸馏水(平.直.慢)；用固定液冲洗3 3次(平.直.慢)； 浸没全部材料，处理15-30min15-30min；五五 实验方法与步骤实验方法与步骤注意事项:酶解过度时不冲洗；固定液鲜配鲜用。作用杀死细胞，保留分裂图象；使细胞质蛋白变性和沉淀,清晰染色体图象促进染色体着色。7 7、制片或涂片、制片或涂片第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备五五 实验方法与步骤实验方法与步骤制片结束后,自然干躁30分钟或火焰干躁。注意 酶解不够时多次加醋酸多次敲打; 酶解过度时宜涂抹制片不敲打。取干净玻片2张，放滤纸上，加盖1张滤纸，吸干水；取1/2/2根尖材料分别放张玻片中央，滴1-2滴固定液；用铅笔头垂直敲打材料20次；集中材料加45%醋酸1-2滴再次敲打20次；借助醋酸液表面张力将细胞引开。8 8、染色、染色 方法Giemsa母液:缓冲液=1:7配成稀释液;浸没全部材料；室温染色15-30min;染色后, ,用小流量自来水冲洗玻片至无色。注意染色前材料要一定要干，否则着色不佳植物进化阶段低或固定时间长易着色,反之则反。第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备五五 实验方法与步骤实验方法与步骤9 9封片保存封片保存第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备 经观察,染色体标本符合要求时，用二甲苯透明、加盖玻片、滴中性树胶封片,制成永久玻片。 永久玻片标签要注明材料名称、分裂时期、制片时间和制作者姓名等信息。物种：绿豆根尖物种：绿豆根尖细胞有丝分裂细胞有丝分裂2008.11.122008.11.12姓名：姓名：.五五 实验方法与步骤实验方法与步骤第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备1 1分裂细胞观察分裂细胞观察六六 实验观察实验观察 低倍镜找分裂细胞区,高倍镜观察染色体形态。估计染色体数目。 40倍下观察，记录3个视野的细胞总数、分裂细胞和典型染色体细胞数；计算出分裂细胞及典型染色体图象细胞频率。2 2分裂时期及染色体形态观察分裂时期及染色体形态观察第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备 尽量寻找下列分裂期染色体图像。前 期中 期 后 期末 期六六 实验观察实验观察第一部分第一部分 植物染色体标本制备植物染色体标本制备六六 实验观察实验观察洋葱根尖细胞染色体百合根尖细胞染色体绿豆根尖细胞染色体3. 3. 典型染色体标本进行显微照相一、植物染色体核型分析简述一、植物染色体核型分析简述第二部分第二部分 植物染色体核型分析植物染色体核型分析核型分析包括核型：核内染色体原图及其序排图分析组型：许多细胞染色体相对长度均值绘制的模式图分析；染色体长度、臂指数和着丝粒指数等参数描述及其分析。 植物核型分析标准是19841984年8 8月我国第一次植物染色体学术会陈瑞阳等人制定的建议标准。已经成为我国及其他部分国家动、植物染色体分类的约定标准。二、植物染色体二、植物染色体核型分析的约定标准核型分析的约定标准第二部分第二部分 植物染色体核型分析植物染色体核型分析1 1、染染色色体体基基数数确确定定：3030个细胞中染色体数目恒定率达85%85%以上；2 2、染色体绝对长度、染色体绝对长度m = m = 放大染色体长度(mm)/(mm)/放大倍数100010003 3、染色体相对长度、染色体相对长度(%)(%)= 绝对长度(m)/(m)/染色体组总长度(m)100(m)1004 4、臂比、臂比 = 染色体长臂短臂；着丝粒指数 = 短臂/该染色体长度5 5、染色体形态分类：、染色体形态分类：引用DenverDenver国际染色体命名标准。三、三、植物核型分析与核型分析软件应用植物核型分析与核型分析软件应用1.点击karyotypingkaryotyping软件,点击“ ”打开绿豆照片,出现图12.选择分类器：点击物种染色体分类系统，建立绿豆物种名 （一）打开软件，建立物种名第二部分第二部分 植物染色体核型分析植物染色体核型分析三、三、植物核型分析与核型分析软件应用植物核型分析与核型分析软件应用第二部分第二部分 染色体核型分析染色体核型分析1. 点击“ ”，标记全部染色体2. 点击CleanClean去掉全部非染色体,点击OKOK（二）标记染色体，并除杂第二部分第二部分 染色体核型分析染色体核型分析（三）剪开粘连染色体，使染色体分散1.点击 ，分割连在一起的染色体2.点击 ，移动需要重排的染色体3.点击 ，分开交叉重叠的染色体4.点击 ，清除不需要的染色体三、三、植物核型分析与核型分析软件应用植物核型分析与核型分析软件应用第二部分第二部分 染色体核型分析染色体核型分析（四）染色体配对与长短臂测量1.1.核型分析软件处理后的绿豆根尖染色体 2.2.点击 ，染色体自动配对，再精细配对3.3.用长度测量软件测定染色体长短臂长度三、三、植物核型分析与核型分析软件应用植物核型分析与核型分析软件应用四、植物染色体四、植物染色体核型分析的主要内容核型分析的主要内容第二部分第二部分 染色体核型分析染色体核型分析1.染色体数目及倍性的确定 30个细胞染色体数目稳定率达85%时定数目；完全相同的染色体数定倍性。如绿豆2n=2x=22。2.确定染色体类型、建立核型公式 用染色体绝对长度计算臂比定染色体类型。2n=22=8m+3sm四、植物染色体四、植物染色体核型分析的主要内容核型分析的主要内容第二部分第二部分 染色体核型分析染色体核型分析提供1幅完整的期染色体图象提供1幅染色体序排配对后的染色体图象。染色体按长度从大到小序排，等长时，短臂长者优先。染色体配对序排图3.进行核型图分析四、植物染色体四、植物染色体核型分析的主要内容核型分析的主要内容4.4.进行模式图分析进行模式图分析第二部分第二部分 染色体核型分析染色体核型分析1010 5 5 0 0 5 51010四、植物染色体四、植物染色体核型分析的主要内容核型分析的主要内容5.5.决定核型类型决定核型类型第二部分第二部分 染色体核型分析染色体核型分析 绿豆最长染色体绿豆最长染色体/ /最短最短=1.31/0.53=6.89=1.31/0.53=6.89；臂比大于；臂比大于2 2：1 1的染的染色体有色体有1 1对，比值对，比值=1/11=0.1=1/11=0.1。 根据如下核型分类标准根据如下核型分类标准绿豆核型类型为绿豆核型类型为2C2C。