目的基因：目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因。结构基因的组成转录启动区核糖体识别区编码区转录终止区起译码ATG开读框休止码TAG、TAA、TGA目的基因的获取方法目的基因的获取方法1、直接分离法、直接分离法2、基因文库分离法3、PCR分离法4、化学合成法比较各种方法获得目的基因的优缺点第一节第一节 直接分离法直接分离法一、限制性内切酶法一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组用限制性内切酶把基因组DNA切成不同切成不同大小的片断。大小的片断。酶切酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。体连接。1. 优点优点2. 缺点缺点目的基因目的基因内部内部也可能有该内切酶的切点。也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene适合于从简单的基因组中分离目的基因从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少,获得也比较简单.应用对象应用对象1、对已定序列的、对已定序列的DNA分子分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。2、对已知定位的目的基因、对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。3、即使含目的基因的、即使含目的基因的DNA分子未定序或定位分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从钩出目的基因。二、随机片断化二、随机片断化1. 限制性内切酶局部消化法限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。切开。 内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则）限制性内切酶的选用原则1）4bp的内切酶的内切酶平均每平均每46（4096）bp一个切点。一个切点。2）6bp的内切酶的内切酶平均每平均每44（256）bp一个切点。一个切点。随机程度高。如随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。 内切酶粘性末端内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。能与常用克隆位点相连。（Sau3ABamH I）2. 机械切割法机械切割法（1）超声波）超声波超声波强烈作用于超声波强烈作用于DNA，可使其断，可使其断裂成约裂成约300bp的随机片断。的随机片断。（2）高速搅拌）高速搅拌1500转转/分下搅拌分下搅拌30min，可产生约，可产生约8kb的随机片断。的随机片断。三、物理化学法三、物理化学法 基本原理：DNA分子的两条链存在着GC、AT碱基配对，其中其中GC间存在间存在3个氢键、个氢键、AT间存在间存在2个氢键，个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解浮力密度和解链温度等也明显不同，链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。密度梯度离心法非洲爪瞻5SDNA单链酶解法根据其热稳定海胆DNA目的基因的获取方法1、直接分离法、直接分离法2、基因文库分离法、基因文库分离法3、PCR分离法4、化学合成法 将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基因组整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将切割成大小合适的片断，并将所有这些所有这些片断片断都与适当的载体连接，引入相应的都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中宿主细胞中保存和扩增保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的物体的全部基因全部基因，称为基因文库。，称为基因文库。一、基因文库的构建一、基因文库的构建1. 基因文库（基因文库（gene library）第二节第二节 构建构建基因组文库分离法基因组文库分离法（2 2）目前常用的载体目前常用的载体 2. 构建基因文库的载体选用构建基因文库的载体选用载体能够容载的载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的建完整的基因文库所需要的重组子重组子的数目。的数目。载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片断数目片断数目越少，所需的越少，所需的重组子重组子越少。越少。（1 1）对载体的要求）对载体的要求 载体系列：载体系列： 容量为容量为 36.451 kp cosmid载体：载体： 容量为容量为 45 kb YAC： 容量为容量为 230kb-1700kbBAC: 容量为容量为 300 kb断点完全随机，片断长度合适于载体连接。断点完全随机，片断长度合适于载体连接。（1）染色体）染色体DNA大片段的制备大片段的制备3. 基因文库构建的一般步骤基因文库构建的一般步骤超声波（超声波（300bp）或机械搅拌（）或机械搅拌（8kb）。）。 物理切割法：物理切割法：内切酶内切酶Sau3A进行局部消化。可得到进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。的随机片断。 酶切法：酶切法：（2）载体与基因组）载体与基因组DNA大片段的连接大片段的连接 粘性末端直接连接粘性末端直接连接载体与外源载体与外源DNA大片段的两个末端大片段的两个末端都有相同的粘性末端。都有相同的粘性末端。如：如：Sau3A与与BamHI的酶切末端。的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。直接连接、人工接头或同聚物加尾。人工接头法（人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。各种酶的接头可以向公司定做或购买。各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶粘性末端粘性末端 同聚物加尾同聚物加尾4. 基因组文库的大小基因组文库的大小一个文库要包含一个文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所时所需要的克隆数目。需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文库包含了整个基因组文库包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）f: 插入载体的插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因片断的平均长度占整个基因 组组DNA的的百分数百分数N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）例如：人的基因组是例如：人的基因组是 3109 bp，插入，插入DNA片断的平均片断的平均长度如果是度如果是104 bpN=ln (1-p)ln (1-f)=ln (1-99%)ln (1-f)=GfN=GfG：Genome大小；大小；f：fragment大小大小N=Gf=31091.7104= 1051. cDNA以以mRNA为模板为模板逆转录逆转录出的出的DNA称称cDNA。2. cDNA library二、二、 cDNA文库的构建文库的构建mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物利用某种生物的利用某种生物的总总mRNA合成合成cDNA，再将，再将这些这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称行保存和扩增，称cDNA文库。文库。（1）不含内含子序列不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有）包含了所有编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因。 （4）比）比DNA文库小文库小的多，容易构建。的多，容易构建。4. 构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取3. cDNA文库的特点文库的特点提取总提取总RNA有商业化的试剂盒（有商业化的试剂盒（kit）。）。分离分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。 利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，尾巴，将将mRNA从总从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。等）中分离纯化。 mRNA只占总只占总RNA的的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化的分离纯化 原理原理 mRNA的分离纯化的分离纯化Column（柱）（柱）反转录酶反转录酶（3）cDNA的合成的合成 cDNA第一链合成第一链合成逆转录酶能以逆转录酶能以RNA为模板合成为模板合成cDNA。 用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合（或随机引物）作引物，合成成cDNA的第一链。的第一链。 mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物用用碱碱处理或用处理或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 3 5 5 引物引物cDNA第一链第一链3 5 引物引物 降解降解mRNA模板模板或或RNaseH碱碱剩下的剩下的cDNA单链的单链的3末端一般形成一个末端一般形成一个弯弯回来的双链发卡结构回来的双链发卡结构（机理不明），可成（机理不明），可成为合成第二条为合成第二条cDNA链的引物。用链的引物。用DNA聚聚合酶合成第二链合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链第一链5 cDNA第二链合成第二链合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第二链合成第二链合成去掉发卡结构去掉发卡结构核酸酶核酸酶S1用用核酸酶核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会可以切掉发卡结构（但这会导致导致cDNA中有用的序列被切掉！）。中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 5 3 这种酶能识别这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小，并将其降解成许多小片断片断。妙用妙用RNaseH小片断正好成为小片断正好成为DNA聚合酶的引物，聚合酶的引物，用来合成用来合成冈崎片断冈崎片断。DNA Pol I除去引物并修补后再使用除去引物并修补后再使用DNA连接酶连接酶连成一整条连成一整条DNA链。链。mRNAcDNA3 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 5 引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶cDNA第二链第二链cDNA第一链第一链3 5 RNaseHDNA ligase去引物去引物在双链在双链cDNA末端接上末端接上人工接头人工接头，即可与载，即可与载体连接，转入受体菌。体连接，转入受体菌。 或借助或借助末端转移酶末端转移酶给载体和双链给载体和双链cDNA的的3端分别加上几个端分别加上几个C或或G，成为粘性末端。，成为粘性末端。5.5.cDNA与载体连接：与载体连接：接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶6. cDNA文库的大小文库的大小一个一个cDNA文库要包含文库要包含99%的的mRNA时时所需要的克隆数目。所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1- )p: 文库包含了完整文库包含了完整mRNA的概率（的概率（99%）: 某一种低丰度（不足某一种低丰度（不足14份拷贝）份拷贝）mRNA占细胞整个占细胞整个mRNA的比例的比例N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）1n1n7. cDNA文库与基因组文库相比的优越性表现在1、 cDNA文库以文库以mRNA为材料，特别适用于某些为材料，特别适用于某些RNA病病毒，毒，例如流感病毒；因其不通过DNA中间体，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。2、 cDNA基因文库的筛选比较简单易行基因文库的筛选比较简单易行。他的文库所含的克隆数是基因文库的十分之一，或更少。3、由于每一个由于每一个cDNA克隆都含有一种克隆都含有一种mRNA序列序列，这样，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率在目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低比较低，而相比，而相比之下基因组文库克隆的选择较复杂，假阳性的概率就高。之下基因组文库克隆的选择较复杂，假阳性的概率就高。4、 cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作。直接应用于基因工程操作。原因是：高等真核生物与原核生物在结构组成上的最大区别是前者含有内含子间隔序列含有内含子间隔序列，而后者没有。通过基因文库中筛选的目的基因难以在原核生物中表达。而cDNA是经过转录后得来的其内含子部分已被删除。5、 cDNA克隆还可以用于真核细胞克隆还可以用于真核细胞mRNA的结构和的结构和功能的研究功能的研究一种特异的mRNA在细胞中往往占很小的比例，难以直接研究其序列、结构和功能。一般是通过比较基因组进行确定8. cDNA文库与基因组文库相比的缺点1、受材料来源的影响 2、遗传信息量有限3、 构建的cDNA文库中高丰度的（含量） mRNA含量比低丰度的易得和分离，其实现在构建的cDNA基本上是高丰度的而低丰度的很少三、文库的查询（三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组用目的基因探针与文库中的重组载体进行载体进行Southern blot杂交。杂交。文库文库载体载体探针探针电泳后杂交电泳后杂交放射自显影放射自显影测序分析测序分析目的基因的获取方法1、直接分离法、直接分离法2、基因文库分离法3、PCR分离法4、化学合成法第三第三节 PCR扩增获得目的基因扩增获得目的基因 如果知道目的基因的全序列知道目的基因的全序列或其两端的序列，通过合成一对与引物互补的引物，就可以十分有效的扩增出所需的目的基因。省时省力1. 直接从基因组中扩增直接从基因组中扩增（1）提取基因组）提取基因组DNA作模板作模板（2）根据目的基因序列设计引物）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增扩增真核生物基因组含有内含子！真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。适合扩增原核生物基因。原核基因组部分原核基因组部分原核细胞原核细胞提取基因组提取基因组DNAPCR扩增扩增（1）提取基因组）提取基因组 total RNA（2）反转录合成总）反转录合成总cDNA作模板作模板（4）PCR扩增扩增（3）根据目的基因序列设计引物）根据目的基因序列设计引物2. 从从mRNA中扩增中扩增: RT-PCR原核生物不易得到原核生物不易得到mRNA，也不含有，也不含有polyA尾。尾。适合扩增真核生物基因。适合扩增真核生物基因。目的基因目的基因 的引物的引物1反转录成目的基因反转录成目的基因cDNA第一链第一链目的基因目的基因 的引物的引物2目的目的 基因基因cDNA第二链第二链PCRmRNA值得注意的是值得注意的是常规PCR，可以合成的DNA片段长度有限，一般在1KB以内，大于他扩增效果显著下降。？未知序列的DNA更长的DNA特殊类型的PCR1、套式PCR（nested PCR） 利用两对引物，从一个模板的同一区域扩增出不同长度而设计的特殊方法。他较常规PCR灵敏度大大提高，同时也能有较强的特异性。2、不对称PCR利用引物浓度不同（50：1或100：1）-单链DNA，用作DNA序列分析的模板。3、反向PCR未知序列的一种PCR方法条件为：条件为：此未知序列的某侧序列必须已知此外，还有锚定PCR，长程PCR，锅柄PCR，等等目的基因的获取方法1、直接分离法、直接分离法2、基因文库分离法3、PCR分离法4、化学合成法1976年年H.G. Khorana提出了用化学方法提出了用化学方法合成基因的设想，并于合成基因的设想，并于1979年在年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸酸tRNA基因的论文。基因的论文。第四节第四节 化学合成目的基因化学合成目的基因一、目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法固相合成法自动化合成法。自动化合成法。 保护保护dNTP的的5端端P 或或3端端-OH 用酸或碱的脱保护用酸或碱的脱保护（1）原理）原理1. 磷酸二酯法磷酸二酯法 带保护的单核苷酸连接带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。保证合成反应的定向进行。带带5保护的单核苷酸与带保护的单核苷酸与带3保护的另一保护的另一个单核苷酸以个单核苷酸以磷酸二酯键磷酸二酯键连接起来。连接起来。具体做法：将一个大的保护基团，如芳香磺酰氯（ArSO2Cl）或二环己基碳二亚胺（DCC）加到脱氧核苷酸的3或5羟基上。这样，具有5-保护的单核苷酸，便能够通过它的5-OP同另一个3-保护的单核苷酸的3-OH之间定向地形成一个二酯键，从而使它们缩合成两端都受保护的二核苷酸分子。实验中使用的各种不同的保护基团，有些可以通过酸处理移去，有些可以通过碱处理移去。所以不论是5-的保护基团还是3-的保护基团，都可以通过酸或碱的脱保护作用而除掉。这样的一个带5-保护的合成的二核苷酸分子，又能够同另一个带3-保护的单核苷酸或二核苷酸进行第二次缩合反应，形成一个三核苷酸或四核苷酸分子。原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在单核苷酸都是在3端磷酸和端磷酸和5-OH上都先上都先连接了一个保护基团。连接了一个保护基团。2. 磷酸三酯法磷酸三酯法 将第一个核苷酸的将第一个核苷酸的3-OH端固定在端固定在固相支持物固相支持物上。上。 固相磷酸三酯合成法固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。是目前通用的合成方法。15合成的二核苷酸连接处有三个酯键！合成的二核苷酸连接处有三个酯键！固相磷酸三酯合成固相磷酸三酯合成过程过程固相支持物固相支持物结果是全保护的结果是全保护的DNA：5 DMT, 3固相支固相支持物持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护核苷酸之间对氯苯。最后脱保护固相固相 支持物支持物固相固相 支持物支持物C化学合成的化学合成的DNA片断一般在片断一般在200bp以内。以内。 二、二、 化学合成化学合成DNA片断的组装片断的组装用用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使各个片段的使各个片段的5端带端带上磷酸。上磷酸。1. 互补连接法互补连接法预先设计合成的片断之间都有预先设计合成的片断之间都有互补互补区域区域，不同片断之间的互补区域能，不同片断之间的互补区域能形成有形成有断点断点的完整双链。的完整双链。（2 2）5端磷酸化端磷酸化（1 1）互补配对）互补配对（合成的（合成的DNADNA单链的单链的55端是端是-OH-OH）T4 DNA连接酶连接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使使5-OH磷酸化磷酸化完整的完整的DNA双链双链（3 3）连接酶连成完整双链连接酶连成完整双链2. 互补延伸连接法互补延伸连接法预先设计的片断之间有预先设计的片断之间有局部互补区局部互补区，可以，可以相互作为另一个片断延长的引物，用相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶聚合酶延伸成完整的双链。延伸成完整的双链。3 5 5 3 5 3 T4DNA连接酶连接酶Klenow片段片段引物引物1. 直接合成基因直接合成基因三、三、 寡聚核苷酸化学合成的优点寡聚核苷酸化学合成的优点2. 合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很难作的含量很低，很难作cDNA 3. 合成探针序列合成探针序列4. 定点突变合成定点突变合成合成带有合成带有定点突变定点突变的基因片断。的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低）有些基因比较短，化学合成费用较低DNA合成仪合成仪5. 合成人工接头或衔接物合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点含有各种酶切位点人工接头人工接头（Adaptor）或）或衔接物衔接物（Linker）序列。）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor克克隆隆外外源源基基因因