阻塞性肺气肿的发病机制阻塞性肺气肿的发病机制正常正常COPD阻塞性肺气肿，是气道远端部分膨阻塞性肺气肿，是气道远端部分膨胀（包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺胀（包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡）并伴有气腔壁的破坏、肺泡囊和肺泡）并伴有气腔壁的破坏、肺弹性减退及肺容量增大的一种疾病。弹性减退及肺容量增大的一种疾病。蛋白酶蛋白酶蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂CD8+CD8+淋巴细胞淋巴细胞吸烟吸烟 O O2 2 / H/ H2 2O O2 2 / HO/ HO肺泡巨噬细胞吞噬功能下降肺泡巨噬细胞吞噬功能下降嗜中性粒细胞化学趋动因子嗜中性粒细胞化学趋动因子白介素白介素 （IL-8IL-8），），TNF- 介质（介质（LTB4LTB4）嗜中性粒细胞嗜中性粒细胞嗜中性细胞弹性蛋白酶嗜中性细胞弹性蛋白酶组织蛋白酶组织蛋白酶基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶 - -抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶SLP1SLP1TIMPS TIMPS 肺泡壁破坏肺泡壁破坏（肺气肿）（肺气肿）发病机制树突状细胞树突状细胞破坏弹力纤维破坏弹力纤维气流受限气流受限粘液分泌增加粘液分泌增加纤毛运动减退纤毛运动减退反反复复感感染染气道慢性炎症，气气道慢性炎症，气道重塑道重塑发病机制发病机制 气道炎症气道炎症 氧化应激氧化应激蛋白酶蛋白酶/ /抗蛋白酶失衡抗蛋白酶失衡自主神经系统功能紊乱自主神经系统功能紊乱（如胆碱能神经受（如胆碱能神经受体分布异常）体分布异常）气道炎症气道炎症COPDCOPD中的炎症细胞中的炎症细胞树突状细胞树突状细胞中性粒细胞中性粒细胞巨噬细胞巨噬细胞T T淋巴细胞淋巴细胞 B B淋巴细胞淋巴细胞 嗜酸粒细胞嗜酸粒细胞上皮细胞上皮细胞 成纤维细胞参与参与COPDCOPD的炎症介质的炎症介质趋化因子：趋化因子：LTB4 吸引中性粒细胞和吸引中性粒细胞和T T淋巴细胞淋巴细胞IL-8 吸引中性粒细胞和单核细胞吸引中性粒细胞和单核细胞前列腺素前列腺素致炎因子致炎因子：TNF- 、IL-6 放大炎症反应放大炎症反应生长因子：生长因子：转化生长因子转化生长因子- - 诱导小气道纤维化诱导小气道纤维化 MCP-1. GM-CSF . ET-1. PAF MCP-1. GM-CSF . ET-1. PAF 等可能参与等可能参与COPD:以炎症为核心的多因素构成的疾病炎症细胞数量/活性增加促炎转录因子.核因子-B（NF-B）炎症介质水平升高:IL-8,TNF-,LTB-4和氧化剂引起蛋白酶/抗蛋白酶失衡杯状细胞增生/化生粘液腺肥大平滑肌质量增加气道纤维化肺泡破坏营养状态差BMI降低骨骼肌损伤虚弱无力失去肺泡附着弹性回缩力丧失平滑肌收缩增强结构改变结构改变支气管收缩支气管收缩全身表现全身表现粘液纤毛功粘液纤毛功能障碍能障碍气流受限气流受限气道炎症气道炎症粘液分泌过多粘液纤毛运输减少粘膜损伤氧化应激氧化应激香烟烟雾和其它吸入颗粒能产生氧化物：H2O2，脂质过氧化物，CO,NOCOPD患者内源性抗氧化物产生下降COPD患者呼出气浓缩物、痰、血中氧化应激的标志物（如过氧化氢和 8- isoprostane）增加 血浆抗氧化能力下降氧化应激对肺组织的不利影响激活炎症基因使抗蛋白酶失活刺激粘液高分泌导致糖皮质激素的抗炎活性下降蛋白酶蛋白酶/ /抗蛋白酶失衡抗蛋白酶失衡 COPD患者肺组织中分解结缔组织的蛋白酶和 对抗此作用的抗蛋白酶之间存在失衡弹性蛋白是肺实质结缔组织的主要成分，蛋白 酶引起弹性蛋白破坏，是导致肺气肿的重要原因，并且是不可逆的肺气肿的形成主要与由巨噬细胞及其源性的基质金属蛋白酶起主导作用参与参与参与参与COPDCOPDCOPDCOPD的蛋白酶和抗蛋白酶的蛋白酶和抗蛋白酶的蛋白酶和抗蛋白酶的蛋白酶和抗蛋白酶蛋白酶增加丝氨酸蛋白酶中性粒细胞弹性蛋白酶组织蛋白酶 G蛋白酶3颗粒酶A,B,C 组织蛋白酶 B,K,L,S基质金属蛋白酶（MMPs）MMP-8,MMP-9,MMP-12，MMP-2抗蛋白酶减少1-抗胰蛋白酶1-抗糜蛋白酶A2-巨球蛋白分泌型白细胞蛋白酶抑制剂MMP1-4组织抑制剂（TIMP1-4）COPD病理学特点病理学特点气道气道炎症炎症粘膜纤毛粘膜纤毛功能障功能障碍碍气流气流阻塞阻塞气道气道结构结构改变改变炎症细胞数量炎症细胞数量/活性增加活性增加:-树突状细胞树突状细胞-巨噬细胞巨噬细胞-中性粒细胞中性粒细胞,-CD8+淋巴细胞淋巴细胞IL-8,TNF ,LTB4提高提高粘膜水肿粘膜水肿肺泡破坏肺泡破坏上皮增生上皮增生腺体过度增大腺体过度增大杯状细胞变形杯状细胞变形气道纤维组织增气道纤维组织增生生粘液过度分泌粘液过度分泌粘液粘性增加粘液粘性增加减少纤毛转运减少纤毛转运粘膜损伤粘膜损伤平滑肌收缩平滑肌收缩胆碱能释放增加胆碱能释放增加气道高反应性气道高反应性弹性收缩降低弹性收缩降低一、肺脏的变化一、肺脏的变化肉眼：肺脏过度膨肉眼：肺脏过度膨大，失去弹性，大，失去弹性，灰白色。灰白色。镜下：见肺泡壁变薄、胀大，破裂或形成镜下：见肺泡壁变薄、胀大，破裂或形成大泡，血供减少，弹性纤维网破坏大泡，血供减少，弹性纤维网破坏,气道重气道重塑，管腔变窄。塑，管腔变窄。一、肺脏的变化一、肺脏的变化气道改变二、肺血管、心脏改二、肺血管、心脏改变变小血管管腔变窄、闭塞。小血管管腔变窄、闭塞。后期发展成肺心病时有右心改变。后期发展成肺心病时有右心改变。通气功能障碍：肺顺应性通气功能障碍：肺顺应性，RV，FEV1，MVV，最大呼气中期流量，最大呼气中期流量 。换气功能障碍：通气换气功能障碍：通气/血流分布不均匀血流分布不均匀三、肺功能变三、肺功能变化化COPD主要研究方法小鼠COPD模型建立方法小鼠肺功能检查血浆、BALF中细胞因子的ELISA测定肺组织的免疫组织化学分析待测标本的收集和处理气道、肺组织病理形态学分析蛋白电泳westerblot.琼脂糖凝胶电泳RNA的提取及测定和Q-PCR小鼠气道上皮细胞的提取与培养小鼠腹腔巨噬细胞的提取细胞培养基本技术胞培养基本技术.小鼠COPD模型建立方法将小鼠随机分为COPD模型组和正常对照组，模型组（cigarettesmokeexposedgroups，简称CS组）小鼠每天熏烟两次，每次2h，香烟剂量为10支h。两次间隔时间为3-4小时）正常对照小鼠（normalcontrolgroups，简称正常组）不作任何干预，各组大鼠在相同环境下自由饮水和摄食模型制备期间，每星期称量一次体质量，每个月检测一次小鼠肺功能。对照组小鼠不做任何干预。熏烟满6个月后，行肺功能检测、气道、肺组织病理形态学分析、蛋白的检测、血浆和BALF中细胞因子的ELISA测定、肺组织的免疫组织化学分析（熏烟装置包括熏烟箱；通风装置；和监测熏烟箱内的温度，湿度，和气体（氧气，CO）浓度监测装置。）小鼠肺功能检查烟雾暴露停止后，使用小鼠肺功能仪检测小鼠肺功能，测量吸气峰流速（PIF），吸气阻力(RI),肺动态顺应性（Cdyn）等，具体步骤：1%戊巴比妥（0.1ml/g）腹腔麻醉小鼠.固定、备皮、消毒后剪开皮肤，轻柔钝性分离暴露气管，在甲状腺处剪开气管，插入气管插管，放入体描箱，并连接小动物肺功能仪进行肺功能测定，潮气量（10ml/kg），吸气压力8-12cmH2O。呼吸120次/min，吸呼比10:15.待小鼠与呼吸机完全协调后，测定肺通气功能。记录数据,为保证肺功能数据质量,操作均由同一人进行.小鼠肺功能评价小鼠血浆的收集和血细胞涂片的制备经小鼠眼球取出血液。抗凝血（枸椽酸钠抗凝）平衡后，在4以1500rpm离心10min，将血浆分装后，-80保存备用。将0.5ml血细胞装于15ml用3ml双蒸水室温下悬浮二次（70sec、30sec）立即离心（条件同上）,倒除血红蛋白等成份后,将细胞悬浮于1ml培养液中(MEM,DMEM，199均可),吸取其中100ul，用离心涂片机以1500rpm离心6min制备细胞涂片6张以上，过夜后用锡铂纸包存于低温冰箱（-30）支气管肺泡灌洗液的收集及计数每组小鼠经气管插管后，用无菌生理盐水灌洗2次，每次0.8ml，收集得到BALF，之后，打开小鼠胸腔，区肺组织保存于液氮之中待用。将收集的回收BALF(80%一90%）于43000r/min离心10min.收集上清液保存于-80冰箱中；将下层细胞均匀涂布于载玻片，经固定，H-E染色。光学显微镜下进行分类计数，计数200个，计算其中的中性粒细胞，巨噬细胞，淋巴细胞等各占的百分比。小鼠肺组织病理学检查准备小鼠肺组织石蜡切片将小鼠腹腔麻醉后固定实验台上，取出血液标本后，打开胸腔，轻轻剪取右肺其中一小叶肺组织，于生理盐水中快速漂洗表面血迹后，置于4%多聚甲醛中进行固定24小时后取出，用清水快速将残留的甲醛冲洗干净，将标本进行梯度脱水后石蜡包埋，将包埋的肺组织切成月4um的薄片，置于40的温水中展开，用铺好胶的玻片将其捞起，将粘有蜡片的玻片在43烤片机上烤2H，待切片完全干透粘劳后，4保存备用。H-E染色1.二甲苯10minx2次2,.无水酒精5minx2次3.95%酒精5min4.自来水洗5min5.苏木素染液浸5-10s6.自来水冲洗直至发蓝为止7.盐酸酒精(比例为1:99）洗10-20s8.自来水冲洗10s9.70%酒精5min10.80%酒精5min11.90%伊红乙醇洗5-10min12.95%酒精5min13.95%酒精10min14.无水酒精10minx2次15二甲苯10min3次16.采用中性树胶封片17.在37烤箱中过夜18.显微镜下观察小鼠肺组织病理学观察及形态小鼠肺组织病理学观察及形态免疫组化实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)1.PBS缓冲液（ph7.27.4）；NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L,Na2HPO44.3mmol/L,KH2PO41.4mmol/L.20.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。30.5mol/LEDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA&8226;2H2O,用10mmol/LNaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4.1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水1000ml。5.酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6.3%甲醇H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合b油和TBS(PBS)配制8TBS/PBSPH9.09.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本试剂气道粘膜石蜡切片的免疫组化免疫组化染色SP法1）脱蜡、水化2）PBS洗2-3次各5分钟（3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟（4）PBS洗2-3次各5分钟（5）抗原修复（6）PBS洗2-3次各5分钟（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（8）滴加抗50l,室温静置1小时或4过夜或371小时（9）4过夜后需在37复温45分钟10）PBS洗3次每次2分钟（11）滴加抗45-50l,室温静置或371小时（12）抗中可加入0.05%的tween-20.（13）PBS洗3次各5分钟（14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度（15）PBS或自来水冲洗10分钟（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化（17）自来水冲洗10-15分钟（18）脱水、透明、封片、镜检免疫组化SABC法（1）脱蜡、水化（2）PBS洗2次各5分钟（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修复（5）PBS洗5分钟（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（7）滴加抗50l,室温静置1小时或4过夜或371小时（8）PBS洗3次各2分钟（9）滴加生物素化抗，20-3720分钟（10）PBS洗3次各2分钟（11）滴加试剂SABC20-3020分钟（12）PBS洗4次各5分钟（13）DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色（14）脱水、透明、封片、镜检免疫组化问题解答免疫组化问题解答1、染色过强抗体浓度过高或孵育时间过长降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜孵育温度过高超过37度一般在室温20-28度DAB显色时间过长或浓度过高显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准2.非特异性背景染色原因解决方法a操作过程中冲洗不充分每步冲洗3次每次5分钟b组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长c组织中含内原性生物素正常非免疫动物血清再封闭d血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间3染色弱原因解决方法a抗体浓度过低、孵育时间过短提高抗体浓度、孵育时，间不能少于60分钟b试剂超过有效使用时间应更换试剂c操作中添加试剂时缓冲液未沥干每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释（应防止切片干燥）d室温太低低于15度要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4度冰箱过夜e蛋白封闭过度封闭不要超过12分钟,4.染色阴性原因解决方法a操作步骤错误应重试设阳性对照b组织中无抗原设阳性对照以验证试验结果c一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗二抗种属无误肺组织蛋白提取将冻存已称重的肺取出置于冰上，按900ul/mg的比例加入肺组织裂解液，使用肺组织匀浆器匀浆至均匀，然后按250ul/ml的比例加入5xLaemmileSampleBuffer匀浆至果冻样，置于冰上，用超声破碎仪(强度为28%,4son，4soff，共8分钟)，然后离心30min（4,12000rmp/min）取上清液并。分装与1.5ml离心管中，置于-80冰箱中保存。肺组织蛋白浓度测定1.按试剂盒说明书配置工作液和相容性试剂溶液2.标准品空白，标准品，样品空白，和未知样品各加入9ul在孔中心（两个重复）3.每孔加入4ul相容性试剂溶液。4.摇床1min，37孵育15分钟。5.每孔加入260ul工作液，摇床1min，37孵育30min。6室温冷却5min7.使用标准品空白作为空白对照，562nm测吸光度（注意：在室温，吸光度以0.25%/min的速率上升）。8.所有未知蛋白样品的复孔的562nm吸光度值减去样品对照复孔的吸光度值。9.用经过空白对校正的BCA蛋白标准品562nm吸光度值与其浓度（ug/ml）来绘制标准曲线，用标准曲线计算蛋白样品的浓度。10.将所有的蛋白样品按上样量30ug计算体积，用裂解液补齐体积后，加入适量的5xloadingbuffer后，将蛋白在沸水中5min，是蛋白变性，置于冰上5min待用。肺组织蛋白浓度测定1.制备分离胶和浓缩胶2.电泳：120V10min；150V50min3.转膜：300mA，70min4.封闭，5%MILK-TBST中进行封闭，常温下2小时，或者4过夜，5.一抗孵育，常温2H，TBST洗3次，每次10min6.二抗孵育，常温1H，TBST洗3次，每次10min7.成像。8.扫描westerblot条带，用Imagej图像分析仪软件分析免疫印迹的灰度值。分离胶，浓缩胶配置12%10%8%4%超纯水3.8ml4.58ml5.345ml3ml30%甲差4.62ml3.84ml3.075ml0.8ml1.5Tris，Hcl2.88ml2.88ml2.88ml0.5Tris，Hcl1.46mlSDS110ul110ul110ul50ulAP110ul110ul110ul30ulTEMET4.62ul4.62ul4.62ul3ul血浆、BALF中细胞因子ELISA测定酶联免疫分析技术(ELISA)酶联免疫分析的基本原理和方法类型先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。ELISA可用于测定抗体，也可用于检测抗原。常用方法ELISA测定三种类型间接法此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定酶联免疫分析技术(ELISA)间接法操作步骤：用已知抗原包被固相载体；加待检标本，经过温育(372h)，使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无关的物质；加酶标抗抗体再次温育(372h)与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体；加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测光密度值定量测定。酶联免疫分析技术(ELISA)间接法1.包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至110gml，每孔加0.1ml，4过夜。次日洗涤3次。2.加样：加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）3.加酶标抗体：于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37孵育3060分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，371030分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。双抗体夹心法双抗体夹心法此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。见下图：双抗体夹心法操作步骤：用已知特异性抗体包被固相载体；加待检标本，经过温育使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去无关的物质；加酶标特异性抗体，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去未结合的酶标抗体；加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测量光密度值进行定量测定。此法适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。双抗体夹心法用于检测未知抗原的双抗体夹心法：1.包被：用0.05MPH9，碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110gml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml，37孵育0.51小时，洗涤。4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，371030分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。竟争法此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。见下图：竟争法操作步骤1.用已知特异性抗体包被固相载体；2.测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原，经过温育，使二者与固相抗体竞争结合；对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合。分别洗涤，除去未结合的成分；3.加底物显色。对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物显色反应较弱。分别测定两管的光密度(OD)值，根据对照管与测定管OD值之比计算标本中待测抗原含量。Q-PCR实验流程实验流程Q-PCR用途用途Q-PCR实验流程实验流程实验前准备，每天早上到实验室后，先把实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。分钟。超净超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性一次性薄膜手套，薄膜手套，RNA抽提需带口罩。抽提需带口罩。取取EP管管/枪枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完用。取完EP管管/枪头后，袋子及时封好。枪头后，袋子及时封好。橡橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。总总RNA抽提抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1mlTrizol（Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5mlRNasefreeEP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品充分研磨，加入1mlTrizol（Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200l氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNasefreeEP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。RNA提取-RNA质量去基因组去基因组使用RNase-free的DNase（Promega），按以下体系配置反应液，37消化30min，65灭活10min。然后按以下步骤操作：1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），-20静置15min；4下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清；用75乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），超净台风干；加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。四、总四、总RNA纯度和完整性检测纯度和完整性检测纯度检测：取1lRNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。总RNA完整性检测：取RNA样品1l，1琼脂糖凝胶电泳80V20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5srRNA，18srRNA和28srRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。mRNA逆转录逆转录1）在RNasefree的PCR管中配置下列溶液.2）将上述溶液吹打均匀，置85保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性；3）在该PCR管中加入下列试剂（Promega）4）将上述20l反应溶液30保温10min；5）42保温50min；6）85保温10min；7)-20保存。microRNA逆转录逆转录使用茎环逆转录法，原理如下图：.在去RNase的PCR管中配置以下溶液：2）将上述溶液混匀，85孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；3)在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：4）将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30保温10min；5）42孵育50min；6）85孵育10min灭活逆转录酶。定量定量PCR检测检测1.引物测试：根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。（1）一个样品的加样尽可能安排在同一行（2）如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板3正式实验：体系配制：H2O4ulSYBRGreenPCRMasterMix10ul(TOYOBO)(使用前需振荡均匀)上游引物0.5ul（10uM）下游引物0.5ul（10uM）计算好实验中需用多少份体系总体积15ul，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配0.5份-1份体系。总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中4cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。）5把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。上机。琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离2.琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。3.琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。4.蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在69之间，离子强度0.020.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。5.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。琼脂糖凝胶电泳操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。1.选择电泳方法选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。2正确选择凝胶浓度正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.52%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。3.适合的电泳缓冲液适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象4.电泳的合适电压和温度电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象5.DNA样品的纯度和状态样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mMNaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。琼脂糖凝胶电泳操作流程6.DNA的上样的上样正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。7.Marker的选择的选择DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择DNA/HindIII或者DNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象8.凝胶的染色和观察凝胶的染色和观察实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。琼脂糖凝胶的优点.缺点优点优点: :(1)操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。(2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。缺点缺点：1.1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4.4.与与PAGEPAGE相比，分子筛作用小，区带少相比，分子筛作用小，区带少DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。在pH值为8.08.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。操作步骤操作步骤1.准备用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子2.配制1%琼脂糖凝胶及倒胶具体步骤：三角瓶内：0.6g琼脂糖+60ml(0.5TBE)煮胶溶解冷却至60(不烫手)加EB倒板室温下充分凝固垂直向上拔出梳子将胶板放入电泳槽向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面12nm。3.加样将DNA样品（5ul）与6上样缓冲液（1ul）混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内。注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。每加完一个样品要更换枪头，以防止EB污染。4.电泳接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳5.结果观察电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带及其位置，记录实验结果。1、倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温度太高会使制板变形；2、胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔；3、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不要刺穿凝胶；4、EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔；5、紫外线照射不要太久。6注意事项小鼠腹腔巨噬细胞收集及形态观察小鼠腹腔巨噬细胞收集及形态观察1.提前3天小鼠腹腔注射1.5ml3%的巯基乙酸培养基（已经灭毒的溶液）2.巨噬细胞取出a：腹腔内注射1.5ml3%的巯基乙酸培养基三天后，将小鼠以颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡15min，仰卧，固定四肢b:在无菌台中打开小鼠腹部皮毛，操作要轻柔不要破坏腹膜，并用75%酒精局部消毒。C：用10ml注射器吸10mlPBS，从小鼠腹部下方进针，注入小鼠腹腔，并迅速拔出注射器，以免液体外流。D：冲洗小鼠腹腔，提起小鼠尾巴，不断旋转小鼠，让液体与小鼠的大网膜充分接触，以提取更多的细胞。e：轻柔的抽取腹腔内的溶液，f：将回收的小鼠细胞收集在15ml的离心管内，置于冰上，做好标记。巨噬细胞培养巨噬细胞培养1.将收集的巨噬细胞离心，1000rcf离心10min2.弃上清，往细胞沉淀中加入1ml的红细胞裂解液，不断吹打使其成悬浮液，冰上静置5min。3.1000rcf离心10min，弃上清，加入10%DMEM培养基，反复吹打细胞悬浮。4.使用细胞计数板在显微镜下计数细胞，并计算出总的细胞数。5.将收集的细胞平均分配在6孔板中培养。整个过程在无菌条件下操作。血细胞形态正常粒细胞系统形态？1、原始粒细胞：胞体直径1018m，圆形或类椭圆形。胞核较大，约占细胞的2/3以上，圆或类椭圆形，居中或略偏位，核染色质呈细砂粒状，均匀、平坦如一层薄砂，无浓集。核膜薄较模糊，染成淡红色。核仁25个，较小，清楚。胞质量少，染成淡蓝或深蓝似天蓝色，透明绕于核周，无颗粒。过氧化物酶染色阴性，但后期有时也可呈阳性反应。2、早幼粒细胞：胞体直径1220m，较原粒细胞大，圆或椭圆形。胞核大，圆或类椭圆形，位于中央或偏位。核染色质呈粗粒状，较原粒粗，开始聚集。核仁可见或消失。胞质量较多，呈淡蓝、蓝或深蓝色，浆内含大小、形态和多少不一的紫红色非特异的天青胺蓝颗粒，分布不均。过氧化物酶染色阳性。3、中幼粒细胞：（1、）中性中幼粒细胞：胞体直径1018m，圆形。胞核椭圆形或一侧开始扁平，染色质聚集呈索块状，核仁消失。胞质量多，淡红色，内含中等量、大小较一致的特异的中性颗粒，常伴有少数非特异性颗粒。（2）嗜酸性中幼粒细胞：胞体直径1520m，胞核与中性中幼粒细胞相似。胞质内充满粗大、均匀、排列紧密、橘红色的特异性的嗜酸性颗粒。（3）嗜碱性中幼粒细胞：胞体直径1015m，胞核椭圆形，轮廓不清楚，核染色质较模糊。胞质内及核上含有数量不多、排列零乱、大小不等的紫黑色特异的嗜碱性颗粒。4、晚幼粒细胞（1、）中性晚幼粒细胞：胞体直径1016m，呈圆形。胞核明显凹陷呈肾形、马蹄形、半月形，但其核凹陷程度一般不超过核假设直径的一半。核染色质粗糙，排列更紧密，核仁消失。胞浆量多，染浅红色，充满中性颗粒。（2、）嗜酸性晚幼粒细胞：胞体直径1016m，胞核在中央或偏一侧，呈肾形或椭圆形。核质充满着嗜酸性颗粒，其颗粒粗大呈橘红色，大小一致，但有时见到深褐色或紫棕色颗粒。（3、）嗜碱性晚幼粒细胞：胞体直径1014m。胞核固缩呈肾形，轮廓模糊。胞质内及核上含有少量、分布不匀的嗜碱性颗粒。5、杆状核粒细胞：（1、）中性杆状核粒细胞：胞体直径1015m，圆形。胞核凹陷程度超过核假设直径的一半，核径最窄处大于最宽处1/3以上，形态弯曲成带状，粗细均匀，核染色质粗糙呈块状，也可见核呈“S”形、“U”形或“E”形，核两端钝圆染深紫红色。胞质充满中性颗粒。（2、）嗜酸性杆状核粒细胞：胞体直径1116m，圆形。胞核与中性杆状粒细胞相似。胞质充满着粗大的橘红色嗜酸性颗粒。（3、）嗜碱性杆状核粒细胞：胞体直径1012m。胞核呈模糊杆状。胞质内及胞核上含有紫黑色、大小不匀、数量较少的嗜碱性颗粒。6、分叶核粒细胞：（1、）中性分叶核粒细胞：胞体直径1014m，圆形。胞核分叶状，叶与叶之间有细丝相连或完全断开，或者虽未断开，但有粗而明显的切痕。核常分25叶，核染色质浓集或呈较多小块，染深紫红色。胞质丰富，染淡红色，浆内分布着细小紫红色中性颗粒。（2、）嗜酸性分叶核粒细胞：胞体直径1116m。胞核多分为两叶。胞质充满着粗大呈橘红色嗜酸性颗粒。（3、）嗜碱性分叶核粒细胞：胞体直径1012m。胞核可分34叶或分叶不明显，常融合呈堆集状。胞质嗜碱性颗粒呈紫黑色，大小不一，分布不均，常掩盖在核上，以致核的形态看不清，有时很难确定为哪一个阶段细胞。正常单核细胞系统形态？1、原始单核细胞：胞体直径1520m，圆或椭圆形。胞核较大，圆形、类圆形，核染色质纤细，呈疏松网状，结构不清晰，核仁13个。胞质较其它原始细胞丰富，呈灰蓝色，不透明，边缘不规则，有时可见伪足状突出。2、幼稚单核细胞：胞体直径1525m，圆形，不规则形。胞核圆或不规则形，呈扭曲折叠状，有凹陷或切痕，核染色质较原单核细胞粗糙疏松，呈丝网状，核仁隐匿或无。胞质较多，染灰蓝色，可见细小染紫红色的天青胺蓝颗粒。3、单核细胞：胞体直径1220m，圆或不规则形，但常可见钝伪足。胞核形态不规则，常呈肾形、马蹄形、“S”形、分叶形、笔架形并有明显的扭曲折叠。核染色质较细致，疏松呈丝网状或条索状。胞质量多，染灰蓝色和淡粉红色，半透明如毛玻璃样。浆内见更多细小的、分散均匀的灰尘样紫红色天青胺蓝颗粒，有时偶见空泡。4、巨噬细胞：单核细胞进入组织内变成巨噬细胞，定居于组织的特异性巨噬细胞可有不同名称，如肝的枯否细胞等。静止性巨噬细胞原称组织细胞。胞体大小变异甚大，直径2080m，被激活后可达100m以上，外形不规则。胞核圆形、椭圆形、肾形、马蹄形、或不规则形，核染色质呈粗糙海绵状，分布不均匀，可有明显核仁，多为12个。胞质丰富，嗜碱，呈灰蓝色，内含天青胺蓝颗粒，空泡多见，可含有大量吞噬物。、正常淋巴细胞系统形态？1、原始淋巴细胞：胞体直径1018m，圆或椭圆形。胞核核大，位于中央或稍偏一侧，圆或椭圆形，核染色质细致，呈颗粒状，但比原粒细胞稍粗，排列匀称，核膜浓厚，界限清晰，核仁多为12个。染淡蓝色，由于其周围的染色质浓染呈围堤状而常清晰可见。胞质极少，呈淡蓝色，透明，核周界明显，无颗粒。2、幼稚淋巴细胞：胞体直径1016m。胞核圆或椭圆形，偶有小的凹陷，核仁模糊不清或消失，核染色质仍较较细致，胞质较少，淡蓝色，偶有少许深染紫红色天青胺蓝颗粒。3、淋巴细胞：（1、）大淋巴细胞：胞体圆形，直径1215m。胞核椭圆形稍偏一侧，核染色质排列紧密而均匀，浓染呈深紫红色。胞质较多，呈清澈的淡蓝色，可有少量大小不等的天青胺蓝颗粒。（2、）小淋巴细胞：胞体圆形，直径69m，胞核圆形或有小切痕，核染色质聚集紧密成大块状，结块的边缘不清楚，染紫红色。胞质量很少，颇似裸核，如可见，呈淡蓝色，一般无颗粒。正常浆细胞系统形态？1、原始浆细胞：胞体直径1418m，圆或椭圆形。胞核圆形，占细胞的2/3以上，居中或偏位，核染色质呈粗颗粒网状，染紫红色，核仁25个。胞质量多，染深蓝色，不透明，核附近较淡染，无颗粒。2、幼稚浆细胞：胞体直径1216m，多呈椭圆形。胞核圆或椭圆形，占细胞1/2以上，居中或偏位，核染色质较原始浆细胞粗糙紧密，开始聚集，染深紫红色，核仁基本消失，有时隐约可见。胞质量多，染深蓝色，不透明，通常近核处有淡染色区，有时可有空泡及少数天青胺蓝颗粒。3、浆细胞：胞体直径815m，圆或椭圆形。胞核明显缩小，较圆可占细胞1/3以下，偏于细胞一侧，核染色质浓密成块，常排列成车轮状，无核仁。胞浆丰富，染蓝色或红蓝相混的蓝紫色，有泡沫感，核的外侧常有明显的淡染区，浆内常有小空泡，偶见少数天青胺蓝颗粒。血液学检查(3)成纤维细胞淋巴细胞小鼠呼吸道上皮细胞的提取与培养按照右图配置完全培养基，过滤，50ml/支分装，4度保存，有效期为一周。主要材胎料和试剂：小鼠，DMEM/F12F粉末，胎牛血清，牛血清白蛋白，牛垂体提取物，胰岛素，转铁蛋白，表皮生长因子，氢化可的松，链霉蛋白酶，维甲酸，红细胞裂解液，I型胶原，无组织包被的24孔板培养皿胶原包被使用前24h,按3.0mg/mlI型胶原;5XDWEM/F12;0.5mol/LNaOH=4;1;0.15比例配置胶原混合溶液，（胶原偏酸，加入一定比列的NaOH，调节PH值在7.2左右）培养皿冰上垂直放置30min，每孔滴加250ul胶原混合液，37度孵育10min使其凝固，后继续追加150ul胶原溶液，37度孵育至少1h，使其底胶原表面平整，最后在加入0.5ml完全培养基，制作完成，4度保存备用。小鼠气道的分离健康雌雄小鼠，7-8周龄，18-20g/只，小鼠经颈椎脱臼处死，将其固定于手术台上，翘起头部，在其胸腹部有酒精消毒，注意保护口腔和鼻道，免受酒精刺激，无菌条件下沿着腹白线剪开皮肤，暴露腹主动脉，切开放血值流尽，其目的在于避免分离呼吸道上皮细胞时混入过多红细胞，钝性分离肌肉，暴露气管，并将其游离，穿双股5号手术线，在气管上下端各打一松结，在该上端的结上缘切开小口，又注射器吸取适量的PBS将气管内外的血液冲洗干净，让后用装有TIP头的空心导管，深入为5mm左右，西紧原先的结，使得导管固定于气管内部，在下端的结和气管分叉处剪断，取尽可能长的气管段，去除多余的组织。气道组织的消化和红细胞的去除像导管内注入4度预冷的0.05%的链霉蛋白酶，灌洗气道内壁至洁净，当酶液滴了两三滴后结扎游离端，在注入酶液使气道充满。吧气体排尽。再将整段气道浸润在DMEM/F12中，4度孵育过夜，第二天，收集消化液，并用5ml注射器吸取DMEM/F12冲洗气道，收集冲洗液约为5ml，将消化液和冲洗液合并后转移至15ml离心管，并加入红细胞裂解液1000rpm/min离心7min，去除上清液，然后用适量的DMEM/F12充分重悬细胞。成纤维细胞的去将重悬细胞接种于加有完全培养基的无组织包被的培养皿中，约1h后，成纤维细胞由于附着能力好，较呼吸道上皮提前贴壁而被去除，该原理类似差速贴壁法，采用无组织包被的培养皿，更有利于细胞的分离纯化。呼吸道上皮细胞的原代培养当绝大数的成纤维细胞已近贴壁后，取出上清液转移至新的完全培养基的胶原包被培养皿中继续培养，此时应观察旧的培养皿中的呼吸道上皮细胞是否被彻底转移，若没有，可以用完全培养基反复冲洗，进行细胞计数，而后，按每孔5X104个细胞的密度街道24孔板中，每天行换液处理，约7d左右细胞将达到较高的融合度，本法所获细胞可继续传代培养3-4代，但是状态渐差，建议用原代细胞实验。胞培养基本技术胞培养基本技术无菌操作技术体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。体外细胞培养常见问题体外培养细胞的方式体外培养细胞的分型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。3、游走细胞型呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。二悬浮型见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法：1吸光培养瓶中的培养液2加入1-2ml0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。3吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。细胞传代细胞计数培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。血细胞计数器：手工计数细胞血球计数仪；自动计数细胞计数：1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml4大格细胞总数/410000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。细胞冻存和复苏冻存和复苏的原则：慢冻快融如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。低温保护剂的应用在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；2取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（11065106细胞/ml)；3加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。标准程序：当温度在-25以上时，12/min当温度达-25以下时，510/min当温度达-100时，可迅速放入液氮中慢冻程序简易程序1.先将冻存管放入4冰箱，约40min。2.接着置于-20冰箱，约3060min。3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。4.置于液氮罐中长期保存。细胞复苏方法（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中，使其融化（1分钟左右）；（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心3-10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。细菌的污染和检测细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。肉眼直接观察法培养检查法显微镜观察法PCR检测真菌的污染和检测真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。支原体的污染和检测支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2m，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。造成支原体高污染率的原因1.支原体大小0.1-0.8um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45um）2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；4.细胞流通之间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；5.研究或操作人员忽略污染问题；6.已受污染的细胞；7.已受污染的培养基、血清。