实验七淀粉酶活力的测定实验七淀粉酶活力的测定一、实验目的一、实验目的 掌握测定淀粉酶活力的掌握测定淀粉酶活力的掌握测定淀粉酶活力的掌握测定淀粉酶活力的原理原理原理原理和和和和基本方法基本方法基本方法基本方法二、实验原理二、实验原理n n酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能力的大小用力的大小用力的大小用力的大小用酶的活力酶的活力酶的活力酶的活力来表示。酶活力也称酶活来表示。酶活力也称酶活来表示。酶活力也称酶活来表示。酶活力也称酶活性，是以酶在性，是以酶在性，是以酶在性，是以酶在最适温度最适温度最适温度最适温度、最适最适最适最适pHpH等条件下，催等条件下，催等条件下，催等条件下，催化一定的化学反应的化一定的化学反应的化一定的化学反应的化一定的化学反应的初速度初速度初速度初速度来表示。来表示。来表示。来表示。 本本本本实实实实验验验验是是是是以以以以一一一一定定定定量量量量的的的的 - -淀淀淀淀粉粉粉粉酶酶酶酶液液液液，于于于于3737 、pH6.8pH6.8的的的的条条条条件件件件下下下下，在在在在一一一一定定定定的的的的初初初初始始始始作作作作用用用用时时时时间间间间内内内内将将将将淀淀淀淀粉粉粉粉转转转转化化化化为为为为还还还还原原原原糖糖糖糖，然然然然后后后后通通通通过过过过与与与与DNSDNS试试试试剂剂剂剂作作作作用用用用，比比比比色色色色测测测测定定定定求求求求得得得得还还还还原原原原糖糖糖糖的的的的生生生生成成成成量量量量，从从从从而而而而计计计计算算算算出出出出酶酶酶酶反反反反应应应应的的的的初速度，即酶的活力初速度，即酶的活力初速度，即酶的活力初速度，即酶的活力 这这这这里里里里规规规规定定定定，一一一一个个个个淀淀淀淀粉粉粉粉酶酶酶酶活活活活力力力力单单单单位位位位为为为为在在在在3737 、pH6.8pH6.8的的的的条条条条件件件件下下下下，每每每每分分分分钟钟钟钟水水水水解解解解淀淀淀淀粉粉粉粉生生生生成成成成1 1mgmg还还还还原原原原糖糖糖糖所需要的所需要的所需要的所需要的酶量酶量酶量酶量。1U=1mg1U=1mg还原糖还原糖还原糖还原糖/minmL/minmL 酶酶酶酶 三三.实验材料及设实验材料及设备备1 1、材料、材料、材料、材料 淀粉酶液（淀粉酶液（淀粉酶液（淀粉酶液（粗酶液、盐析液、脱盐液粗酶液、盐析液、脱盐液粗酶液、盐析液、脱盐液粗酶液、盐析液、脱盐液）2 2、仪器、仪器、仪器、仪器 分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计 恒温水浴恒温水浴恒温水浴恒温水浴 沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴 3 3、器材、器材、器材、器材 刻度刻度刻度刻度试管：试管：试管：试管： 2525mLmL1717移移移移 液液液液 管：管：管：管： 1 1mL3mL3（取稀释后的酶液）（取稀释后的酶液）（取稀释后的酶液）（取稀释后的酶液）烧烧烧烧杯：杯：杯：杯： 250mL1250mL1滴滴滴滴管：管：管：管： 2 2洗洗洗洗 耳耳耳耳 球：球：球：球： 2 2洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1 1移移移移 液液液液 器：专取器：专取器：专取器：专取NaOHNaOH注注注注 射射射射 器：专取蛋白样品器：专取蛋白样品器：专取蛋白样品器：专取蛋白样品四、试剂的配制四、试剂的配制1 1、淀粉溶液（、淀粉溶液（、淀粉溶液（、淀粉溶液（0.5%0.5%）称取称取称取称取5g5g可溶性淀粉，溶于可溶性淀粉，溶于可溶性淀粉，溶于可溶性淀粉，溶于1000mL1000mL热水中。热水中。热水中。热水中。2 2、3,5-3,5-二硝基水杨酸试剂（二硝基水杨酸试剂（二硝基水杨酸试剂（二硝基水杨酸试剂（DNSDNS试剂）试剂）试剂）试剂） 3 3、磷酸缓冲液（、磷酸缓冲液（、磷酸缓冲液（、磷酸缓冲液（ 0.1mol/L0.1mol/L，pH6.8pH6.8），），），），含含含含0.3%NaCl0.3%NaCl4 4、NaOHNaOH溶液（溶液（溶液（溶液（2.5mol/L2.5mol/L）五五.操作步骤操作步骤1 1、淀粉酶的制备、淀粉酶的制备、淀粉酶的制备、淀粉酶的制备（1 1）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗 酶提取液解冻，取上清液酶提取液解冻，取上清液酶提取液解冻，取上清液酶提取液解冻，取上清液0.05mL0.05mL，加蒸馏水稀释，加蒸馏水稀释，加蒸馏水稀释，加蒸馏水稀释到到到到25mL25mL，摇匀备用，摇匀备用，摇匀备用，摇匀备用（2 2）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析蛋白质解冻，取上清液蛋白质解冻，取上清液蛋白质解冻，取上清液蛋白质解冻，取上清液0.05mL0.05mL，加蒸馏水稀释到，加蒸馏水稀释到，加蒸馏水稀释到，加蒸馏水稀释到25mL25mL，摇匀备用，摇匀备用，摇匀备用，摇匀备用（3 3）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取0.05mL0.05mL，稀释。，稀释。，稀释。，稀释。收集收集收集收集1 1管的同学，将管的同学，将管的同学，将管的同学，将0.05mL0.05mL稀释到稀释到稀释到稀释到1515mLmL收集收集收集收集2 2管的同学，将管的同学，将管的同学，将管的同学，将0.05mL0.05mL稀释到稀释到稀释到稀释到10mL10mL试管排列顺序试管排列顺序空白F1B3B2F3F2F1B3B2B1F3F21淀粉32B1粗酶液粗酶液粗酶液粗酶液盐盐盐盐 析析析析脱脱脱脱 盐盐盐盐0 0时刻时刻时刻时刻5min5min时刻时刻时刻时刻 装约装约装约装约20mL20mL淀粉溶液，淀粉溶液，淀粉溶液，淀粉溶液，标记，转至标记，转至标记，转至标记，转至3737水浴水浴水浴水浴锅中锅中锅中锅中因淀粉中含有少量还原糖，因淀粉中含有少量还原糖，因淀粉中含有少量还原糖，因淀粉中含有少量还原糖，某些溶液有色素、杂质，需某些溶液有色素、杂质，需某些溶液有色素、杂质，需某些溶液有色素、杂质，需查看酶不水解淀粉的情况查看酶不水解淀粉的情况查看酶不水解淀粉的情况查看酶不水解淀粉的情况3737室温室温室温室温实验编号实验编号实验编号实验编号 操作操作操作操作0 0号管号管号管号管粗酶液粗酶液粗酶液粗酶液 (1)(1)盐析液盐析液盐析液盐析液 (2)(2)脱盐液脱盐液脱盐液脱盐液 (3)(3)0 0时刻时刻时刻时刻5min5min时刻时刻时刻时刻 0 0时刻时刻时刻时刻 5min5min时刻时刻时刻时刻 0 0时刻时刻时刻时刻 5min5min时刻时刻时刻时刻B1B1B1B1F1F1F1F1B2B2 B2B2 F2F2F2F2B3B3 B3B3 F3F3F3F3淀粉酶液淀粉酶液淀粉酶液淀粉酶液 (ml)(ml)0.30.30.20.20.50.5HH2 2O(ml)O(ml)3.53.5pH6.8pH6.8缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液各各各各 1ml1ml0.30.3 NaClNaCl各各各各 1ml1ml预热预热预热预热摇匀，摇匀，摇匀，摇匀， 3737水浴水浴水浴水浴 2min2min NaOH(ml)NaOH(ml)1 11 11 11 11 11 1预热的淀粉预热的淀粉预热的淀粉预热的淀粉各各各各 1ml1ml，迅速摇匀，迅速摇匀，迅速摇匀，迅速摇匀酶促反应酶促反应酶促反应酶促反应3737水浴水浴水浴水浴 5min(5min(准确计时准确计时准确计时准确计时) )NaOH(ml)NaOH(ml)1 11 11 11 11 11 1DNSDNS试剂试剂试剂试剂各各各各 2ml2ml，摇匀，摇匀，摇匀，摇匀显色反应显色反应显色反应显色反应沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴 5min5min，冷却，各用水，冷却，各用水，冷却，各用水，冷却，各用水定容至定容至定容至定容至25ml25ml，摇匀，摇匀，摇匀，摇匀比色比色比色比色以以以以0 0号管为空白参比，测定号管为空白参比，测定号管为空白参比，测定号管为空白参比，测定 =540nm=540nm处处的吸光的吸光的吸光的吸光值值记录记录记录记录A A540540六六.结果处理结果处理1 1、分别计算、分别计算、分别计算、分别计算0 0时刻、时刻、时刻、时刻、5min5min时刻的时刻的时刻的时刻的A A540nm540nm平均值。平均值。平均值。平均值。2 2、根据图表中的实验结果，并利用实验、根据图表中的实验结果，并利用实验、根据图表中的实验结果，并利用实验、根据图表中的实验结果，并利用实验“ “3,5-3,5-二二二二硝基水杨酸比色法测定糖的含量硝基水杨酸比色法测定糖的含量硝基水杨酸比色法测定糖的含量硝基水杨酸比色法测定糖的含量” ”中制作的标准中制作的标准中制作的标准中制作的标准曲线，计算淀粉酶的活力。曲线，计算淀粉酶的活力。曲线，计算淀粉酶的活力。曲线，计算淀粉酶的活力。需要详细过程。需要详细过程。需要详细过程。需要详细过程。5min5min时刻吸光值时刻吸光值时刻吸光值时刻吸光值0min0min时刻吸光值时刻吸光值时刻吸光值时刻吸光值5min5min时刻还原糖时刻还原糖时刻还原糖时刻还原糖mgmg数数数数0min0min时刻还原糖时刻还原糖时刻还原糖时刻还原糖mgmg数数数数二者相减，计算酶活力。二者相减，计算酶活力。二者相减，计算酶活力。二者相减，计算酶活力。 1U=1mg1U=1mg还原糖还原糖还原糖还原糖/min/min mLmL 酶酶酶酶* *稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数七七.思考题思考题1 1、在测定酶活力时应注意哪些反应条件？为什么？、在测定酶活力时应注意哪些反应条件？为什么？、在测定酶活力时应注意哪些反应条件？为什么？、在测定酶活力时应注意哪些反应条件？为什么？2 2、本实验中、本实验中、本实验中、本实验中两次两次两次两次加入加入加入加入NaOHNaOH溶液的溶液的溶液的溶液的意义意义意义意义是什么是什么是什么是什么? ? ? ?八、分析八、分析1. 1.三种酶活力大小顺序是怎样，为什么是这样？三种酶活力大小顺序是怎样，为什么是这样？三种酶活力大小顺序是怎样，为什么是这样？三种酶活力大小顺序是怎样，为什么是这样？2. 2.酶液的稀释倍数是否要改变。酶液的稀释倍数是否要改变。酶液的稀释倍数是否要改变。酶液的稀释倍数是否要改变。3. 3.计算酶液的总活力、回收率。计算酶液的总活力、回收率。计算酶液的总活力、回收率。计算酶液的总活力、回收率。