T-A基因克隆的技术要点基因克隆的技术要点08应生 狄天元Page 2主要内容主要内容（一）重组（一）重组T质粒的构建质粒的构建 （二）重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定（二）重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定 1. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备 2. 重组重组DNA的转化的转化 3. 重组质粒的鉴定重组质粒的鉴定 Page 3T-A克隆克隆T-AT-A克隆方法克隆方法克隆方法克隆方法（Original TA Cloning Kit） 是把是把5-A突出的突出的PCR片断与一个具有片断与一个具有3-T突出的载体突出的载体DNA连接起来的方法。连接起来的方法。PCR反应中所适用的聚合酶具有反应中所适用的聚合酶具有末端转移末端转移的活性，通常在的活性，通常在5加加上上A。只有用经过特殊处理的具有只有用经过特殊处理的具有3-T突出末端的突出末端的DNA片断才片断才能通过能通过T/A配对进行连接。配对进行连接。比平头连接效率高比平头连接效率高50100倍。倍。 Page 43-A突出的突出的PCR产物产物使用不同的使用不同的Taq酶，在酶，在PCR扩增循环结束后，加上扩增循环结束后，加上7210分钟分钟一个过程，一个过程，Taq酶可以在扩增产物的酶可以在扩增产物的3末端加上末端加上A 。使用高保真的使用高保真的DNA聚合酶，如聚合酶，如pfu酶，其不能在扩增产物的酶，其不能在扩增产物的3末末端加上端加上A，得到的，得到的DNA序列为钝端，因此，在回收纯化后进行序列为钝端，因此，在回收纯化后进行加加A的过程，通常是以的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普回收产物为模板，加上一定量的普通通Taq酶和反应液，加入酶和反应液，加入dATP（或（或dNTP），）， 72 10分钟。分钟。Page 5T载体载体一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，再在再在70或或72下在只加入下在只加入dTTP的反应体系中用的反应体系中用Taq DNA聚聚合酶处理半小时合酶处理半小时（也有人报道处理（也有人报道处理12小时能提高克隆效率，这样加小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自反应。载体自连、连、PCR产物串连可以忽略。产物串连可以忽略。如果使用如果使用ddTTP，效果会更好。，效果会更好。Page 6T载体载体pMD 18-T Vector 是一种高效克隆是一种高效克隆PCR产物产物 (TA Cloning)的专用载体。的专用载体。它由它由pUC18载体载体改建而成。在改建而成。在pUC18载体的多克隆位点处的载体的多克隆位点处的Xba I 和和Sal I识别位点之间插入了识别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用识别位点，用 EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的进行酶切反应后，再在两侧的3端添加端添加“T”而成。而成。pUCm-T 由由pUC-19改建而成。改建而成。Page 7pUC18载体载体Page 8pMD18-T Vector Page 9pUCm-TPage 10pUCm-T的多克隆位点的多克隆位点Page 11PCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序Page 12大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备原理原理受体细胞经过一些特殊方法（如受体细胞经过一些特殊方法（如CaCl2等化学试剂法）的处理等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许许多外源后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许许多外源DNA的载的载体分子通过的感受态细胞（体分子通过的感受态细胞（competent cell）。）。Page 13大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备操作方法操作方法1）取）取1支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2mL LB（不含（不含抗生素）培养基。抗生素）培养基。2）从超低温冰柜中取出）从超低温冰柜中取出DH5菌种，取菌种，取2L菌液接入含菌液接入含2mL LB 培养基的试管中，培养基的试管中，37C摇床培养过夜。摇床培养过夜。3）次日取）次日取0.5mL上述菌液转接到含有上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧培养基的三角烧瓶中，瓶中，37C下下250r/min摇床培养摇床培养23h，测定，测定A590为为0.375 （0.4，细胞数，细胞数108/mL，此为关键参数）。，此为关键参数）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。4）将菌液分装到）将菌液分装到1.5mL预冷无菌的预冷无菌的Ep管中，于冰上放置管中，于冰上放置 10min，然后于，然后于4 C下下5000r/min离心离心10min。Page 14大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备操作方法操作方法5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1mL冰冷的冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液，立即在快速混匀器上混匀，插入冰中放置溶液，立即在快速混匀器上混匀，插入冰中放置 30min。6）4 C下下5000r/min离心离心10min，弃上清液后，用，弃上清液后，用1mL冰冷的冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬，插入冰中放置溶液重悬，插入冰中放置30min。7）4 C下下5000r/min离心离心10min，弃上清液后，用，弃上清液后，用200L冰冷的冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌液，超净工作台中按每管溶液重悬菌液，超净工作台中按每管100L分分装到装到1.5mL离心管中。可以直接用做转化实验，或立即放入离心管中。可以直接用做转化实验，或立即放入 -80C超低温冰柜中保藏（可存放数月）。超低温冰柜中保藏（可存放数月）。8）在被细菌污染的桌面上喷洒）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。乙醇，擦干桌面。Page 15外源外源DNA的重组与转化的重组与转化DNA的体外连接重组的体外连接重组其本质是一个酶促反应过程，即在一定的条件下，其本质是一个酶促反应过程，即在一定的条件下，DNA连接酶连接酶催化两个双链催化两个双链DNA片段的片段的5端磷酸和端磷酸和3端羟基之间相互作用，端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。形成磷酸二酯键的过程。DNA连接酶有两种：连接酶有两种：T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶 大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶。连接酶。 其中其中T4 DNA连接酶连接酶对作用底物要求低，能更有效地连接对作用底物要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更为广泛。的平末端，应用更为广泛。Page 16外源外源DNA的重组与转化的重组与转化T4 DNA 连接酶催化连接酶催化DNA 连接反应分为连接反应分为3 步：步：首先，首先，T4 DNA 连接酶与辅因子连接酶与辅因子ATP通过通过T4 DNA 连接酶中亮连接酶中亮氨酸的氨基与氨酸的氨基与ATP中的磷酸作用形成酶中的磷酸作用形成酶-ATP复合物；复合物；然后，酶然后，酶-ATP复合物活化复合物活化DNA的的5端的磷酸集团，通过磷酸端的磷酸集团，通过磷酸-磷酸键结合到磷酸键结合到 DNA分子上，使分子上，使DNA腺苷酸化；腺苷酸化；最后，最后，DNA链链3端的羟基活化，取代端的羟基活化，取代ATP后与后与DNA链链5端的磷端的磷酸根形成磷酸二酯键，释放出酸根形成磷酸二酯键，释放出AMP，完成，完成DNA的连接。的连接。Page 17外源外源DNA的重组与转化的重组与转化转化转化是指质粒是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。原理原理细菌处于细菌处于0C时，时，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的混合物中的DNA形成抗形成抗DNA酶的羟基酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经胞表面，经42C短时间热击处理，促进细胞吸收短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得新的表型（如程中获得新的表型（如Amp+等）得到表达，然后将此细菌培等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上进行培养获得阳性养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上进行培养获得阳性克隆。克隆。Page 18外源外源DNA的重组与转化的重组与转化重组（连接）重组（连接）1）取）取1支无菌支无菌Ep管，用微量进样器按下表顺序加入各成分。管，用微量进样器按下表顺序加入各成分。组分组分体积（体积（ L ）重蒸水重蒸水1110T4 连接酶缓冲液连接酶缓冲液2T载体载体3（约（约0.1g）PCR扩增的扩增的DNA片段片段3（约（约0.4g）T4 DNA连接酶连接酶1（2U）总反应体系总反应体系20表表1 连接反应体系连接反应体系Page 19外源外源DNA的重组与转化的重组与转化重组（连接）重组（连接）2）盖好盖子，用手指轻弹）盖好盖子，用手指轻弹Ep管数次，并于台式离心机离心管数次，并于台式离心机离心2s以以集中溶液。集中溶液。3）将反应管于）将反应管于16C的条件下，连接过夜（的条件下，连接过夜（1216h）。）。Page 20外源外源DNA的重组与转化的重组与转化转化转化（第二天上午进行）（第二天上午进行）取取200 L摇匀的感受态细胞悬液（如果是冷冻保存液，则需解摇匀的感受态细胞悬液（如果是冷冻保存液，则需解冻后立即使用），加入冻后立即使用），加入10 L连接产物，轻轻摇匀，勿吹打，连接产物，轻轻摇匀，勿吹打，冰上放置冰上放置30min，于，于42C温育温育2min后，迅速冰浴冷却后，迅速冰浴冷却3min.加加入入300 L的预热的预热LB液体培养基液体培养基（SOC培养基）培养基），使总体积约，使总体积约为为0.5mL，该溶液称为转化反应原液。摇匀后于，该溶液称为转化反应原液。摇匀后于37C、100r/min摇床培养摇床培养60min，3000r/min离心离心4min后去上清，用后去上清，用枪头轻吹管底悬浮沉淀，接种于汗抗生素的枪头轻吹管底悬浮沉淀，接种于汗抗生素的LB平板培养基上，平板培养基上，涂匀。静置涂匀。静置15min，待菌液被培养基吸收，倒置平板，待菌液被培养基吸收，倒置平板， 37C培培养养1216h，观察菌落生长情况，待菌落生长良好而又未互相，观察菌落生长情况，待菌落生长良好而又未互相重叠时，停止培养。重叠时，停止培养。Page 21重组质粒的鉴定重组质粒的鉴定蓝白斑筛选法蓝白斑筛选法由由pUC18载体构建的载体构建的pMD 18-T Vector含有复制起点（含有复制起点（ori），），青霉素抗性基因（青霉素抗性基因（Amp）以及）以及lacZ的启动子及编码的启动子及编码-肽链的肽链的DNA序列，并且在序列，并且在lacZ基因中有一段多克隆位点（基因中有一段多克隆位点（MCS）区）区段。当外源的段。当外源的DNA片段插入到这些克隆位点时，使片段插入到这些克隆位点时，使-互补链破互补链破坏形成的是无活性的坏形成的是无活性的-半乳糖苷酶，于是被转化的大肠杆菌细半乳糖苷酶，于是被转化的大肠杆菌细胞，就在胞，就在Xgal - IPTG培养基培养基上形成白色菌落，而相反没有外源上形成白色菌落，而相反没有外源DNA插入的质粒转化大肠杆菌细胞后，在插入的质粒转化大肠杆菌细胞后，在Xgal-IPTG培养基上培养基上形成蓝色菌落。形成蓝色菌落。lacZ 编码半乳糖苷酶的编码半乳糖苷酶的N端，它可以和宿主菌株产生的半乳糖苷酶端，它可以和宿主菌株产生的半乳糖苷酶C端互端互补，形成有活性的补，形成有活性的-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。Xgal 5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷 ，半乳糖苷酶的底物，水解后呈半乳糖苷酶的底物，水解后呈蓝色蓝色IPTG 异丙基硫代半乳糖苷，异丙基硫代半乳糖苷，半乳糖苷酶的活性诱导物质半乳糖苷酶的活性诱导物质 Page 22蓝白斑蓝白斑Page 23蓝白斑蓝白斑Page 24蓝白斑蓝白斑