临床微生物标本的采集无锡市第二人民医院检验科胡锡池正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提！标本采集、运送是分析前质量控制的重要部分。分析前程序包括：从临床医生开出医嘱开始,到分析检验程序时终止的步骤, 包括检验申请、患者的准备、原始样品的采集、运送到实验室并在实验室进行传输。临床反馈不满意的检验结果中, 有80%的报告最终可溯源到标本质量不符合要求。微生物样本采样基本原则1.及时采集微生物标本作病原学检查；2.在抗菌药物使用前采集标本；3.采样时严格执行无菌操作；4.采样后立即送检；5.标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂；6.送检标本应注明来源和检验目的；7.混有正常菌群污染标本，不可置液体培养基。不可增菌各类标本储存的环境4冰箱 ：痰、尿液、粪便、活检组织、气管冲洗物、导尿管、心包积液、脓和伤口分泌物等。室温（25）： 脑脊液、泌尿生殖道、眼、耳、鼻、喉、血液培养、血管导管尖、体液 、厌氧菌培养标本。常见不合格标本主要原因标本采集时间错误；容器错误；标本量不足；标本未及时正确运送；以及暂存条件错误；。临床微生物检验重要样本类型血液培养脑脊液培养呼吸道标本培养尿液培养生殖道样本培养粪便培养其他无菌体液或分泌液血培养的采集规范血培养采集的指征当怀疑血流感染或脓毒症时，应常规行血培养。怀疑患者有血流感染的症状有：不明原因的发烧(38)或体温过低(36)白细胞增多（ 10,000/ul），粒细胞减少（ 1,000ul）休克，寒颤，僵直血培养采集的指征血流感染的症状有：严重的局部感染(脑膜炎，心内膜炎，肺炎，肾盂肾炎，腹部术后感染，)心率异常加快低血压或高血压呼吸频率加快新生儿可疑菌血症,可以增加做尿液和脑脊液培养。关于采血时机尽可能在患者寒战或开始发热时采血；在患者接受抗生素治疗前采血；如患者已经应用抗菌药物进行治疗，应在下一次用药之前采血培养。血培养采集的消毒皮肤消毒培养瓶消毒皮肤消毒程序，严格执行三步法:1、用75%酒精擦拭静脉穿刺部位待30s以上；2、用1%-2%碘酊作用30s或10%碘伏作用60s，从穿刺点向外画圈消毒,至消毒区域直径达3cm以上，涂擦穿刺皮肤2遍，待干燥。3、75%酒精脱碘：用75%酒精由内向外方向涂抹去碘酒液 ，待酒精挥发干燥后采血。培养瓶的消毒1. 去掉培养瓶口的塑料瓶盖。2. 75%酒精消毒血培养瓶橡皮塞子60秒。3. 自然待干。4. 将标本注入培养瓶内。5. 颠倒混匀标本与肉汤，以避免血液凝集。关于采血套数与采血部位成人“一套” 血培养应该包括需氧瓶和厌氧瓶各一个，也叫“一份”。注意：一次穿刺采血，算“一套”，采集第二套应从另一个穿刺点获得。最好从另一侧抽血。儿童一般只做需氧培养，但仍需从多个部位采集多次。特殊患者才考虑厌氧培养。Weinstein et al. Detection of Bloodstream Infections in Adults: How ManyBloodCultures Are Needed J Clin Microbiol. 2007; 45:3546-3548每位患者每次采血最少2套，3套更好初发患者，绝不能只采1套标本多个穿刺部位采血。多部位同时发生污染的几率较小，便于对结果进判断采集部位推荐从外周静脉采集血液标本。不推荐动脉血，因其诊断价值没有比静脉血更大。不推荐静脉留置导管，因其常伴有高污染率。如果必须从留置导管内采血，也应同时从外周静脉采集另外一个血培养标本以帮助阳性结果的判读提供解释。关于采集血液量采血量是影响灵敏度最关键因素成人一份标本2个培养瓶（需氧厌氧），每瓶810ml，共20ml；要求至少采两份标本，即40ml。儿童一般只需采集需氧瓶，在保证采集血量1总血量下，一般为13ml采血量不足时应优先保证需氧瓶，因临床90以上的感染为需氧菌或兼性需氧菌感染05040302010采血量(ml)与检出率的关系100908070605101520304045505560ml% RelativeYield25Overall35血培养物每增加一毫升，真性菌血症成年人微生物的检出率增加3但并非越多越好，超过一定数量的采血量会稀释培养瓶内的肉汤，使肉汤无法有效中和血中的抑制物质（补体、抗体、抗生素）。所以血液与肉汤的最佳比例为1：41：10关于各种血液标本的采集顺序血培养对无菌操作的要求比注射、采集生化、凝血等其它标本要高。所以要最先采集血培养标本。培养瓶的储存温度不需冷藏，更不能冷冻。保存在1525的室温即可，温度过低会导致对温度敏感的细菌死亡。呼吸道标本上呼吸道样本下呼吸道样本关于呼吸道标本临床通常将正常人喉以上部位称之为上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道，通常无菌。下呼吸道感染包括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急性发作、支气管扩张继发感染及肺实质感染（肺炎、肺脓肿）等。绝大部分上呼吸道感染局限于口咽、鼻咽和鼻腔部位；常常导致咽痛、鼻炎等。痰及下呼吸道标本痰及下呼吸道标本采集指征痰液标本是临床微生物学检验最常见的标本，但不是下呼吸道感染的最佳标本。有下列体征之一，应进行痰培养：咳嗽、 咳嗽咳痰是下呼吸道感染最常见的症状。咯血，包括泡沫血痰、鲜血和痰中带血等。呼吸困难，呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛。发热伴白细胞增高尤其是中性粒细胞或CRP明显增高。胸部影像学检查提示有感染可能。咳痰标本的采集标本采集方法医师或护士直视下采集标本。病人先漱口用牙刷（不用牙膏）清洁口腔和牙齿，去除表面的菌群。教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液。无痰可用35NaCl 5ml雾吸约5min导痰也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰咳痰标本不合格，退检吗？如果低倍视野下鳞状上皮细胞大于25个，白细胞小于10个，应不做或仅在特殊要求时做培养。如做培养，报告中注明“镜检结果表明标本口咽分泌物污染明显”。样本质量-革兰染色评估样本是否合格不合格的痰标本合格的痰标本几种下呼吸道直接采集的标本经气管穿刺吸引经胸壁针刺吸引经支气管镜采样支气管肺泡灌洗经支气管镜直接吸引防污染样本毛刷开胸肺活检（经人工气道吸引分泌物痰培养的送检次数对于普通细菌性肺炎，痰标本送检每天1次，连续23天。不建议24h内多次采集，除非痰液外观性状出现改变；怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3天清晨痰液送检；痰培养的运送和保存尽快（2h）送至实验室。如不能及时送达，应将标本暂存于4，但放置时间不可超过24h。脑 脊 液关于脑脊液正常人体脑脊液是无菌的。当人体患有脑脊髓膜炎症时，在脑脊液中可以出现病原菌。常见的病原菌有细菌、真菌、结核分枝杆菌等。做脑脊液的细菌培养有助于诊断脑膜炎病因。脑脊液培养标本的采集采集时间：怀疑脑膜炎时应立即采集脑脊液，最是在应用抗生素之前采集脑脊液。采集方法：无菌腰穿采集脑脊液35ml，分装到3个无菌小瓶中（各1 2ml）。用于细菌和病毒检测时脑脊液量不少于1ml；用于真菌和抗酸杆菌检测脑脊液量不少于2ml。脑脊液标本采集标本采集后应置于无菌试管内尽快送检，绝不可冷藏！每种检验需要最小量：细菌培养lml，真菌2ml，抗酸杆菌2ml。标本验收与拒收：标本未收集于无菌管或送检延误或冷藏保存，则拒收标本，通知临床要求重新采集标本。尿培养标本正常人体内的尿液是无菌的，而外尿道有正常菌群寄居。尿液经尿道排出时受到尿道中细菌的污染而混有细菌，但细菌数不超过1000cfu/ml。患有泌尿系感染时，尿中的菌数高于104105cfu/ml ，因而可以此界限作为诊断泌尿系感染的依据。关于尿液标本尿液培养标本采集注意事项（1）最好留取晨起第一次尿液。（2）采集时必须严格进行无菌操作。（3）用药前送检。（4）不能将尿液接种于增菌培养液中。（5）尿液标本不适合做厌氧菌培养（除非经膀胱穿刺取尿），不适合做支原体培养。多次收集或24小时尿不能用作培养。尿培养采集方法清洁中段尿法：是最常用的方法。耻骨上膀胱穿刺法直接导尿留置导尿管收集尿液尿培养的运送和保存室温都有利于病原菌和污染菌会生长繁殖，因此若30min内不能及时培养尿液则必须冷藏，但也不能超过24小时。粪便标本关于粪便标本急性感染性腹泻可以由细菌、病毒及原虫引起，实验室常规检查是细菌培养。沙门氏菌、志贺氏菌、邻单胞菌和气单胞菌应作为实验室常规培养的主要腹泻病原菌。儿童(2岁以内)腹泻多以病毒性肠炎为主，应在腹泻病毒筛选阴性之后，再考虑做细菌培养。粪便标本采集指征当腹泻患者出现以下任何一种情况时建议采集粪便标本，进行细菌培养：粪便涂片镜检白细胞5个/HP；重症腹泻；体温大于38.5；血便；便中有脓液；未经抗菌药物治疗的持续性腹泻患者；来自疫区的患者。粪便标本采集方法标本采集尽可能在发病早期和应用抗菌药物治疗之前。在不同的时间采集2至3份标本可以提高致病菌的分离率。自然排便法直接留置粪便标本于清洁、干燥广口容器中送检。本法为常规方法。注意若有脓血、粘液、组织碎片，则取有脓血、粘液、组织碎片部分的粪便23g，液体粪便则取絮状物，一般取13ml。粪便标本采集方法直肠拭子法用无菌拭子插入肛门2-4cm，轻轻旋转拭子，可在拭子上明显见到粪便，插入运送培养基内，立即送检。本法只适用于排便困难患者或婴幼儿，不推荐使用拭子做常规性病原菌培养。粪便标本运送和验收标本应尽快送检，不能及时送检的标本，室温保存2h。如采便后2h内未培养,标本应放入运送培养基如Cary -Blair运送培养基中4冰箱保存，一般可保存24h。无菌体液标本关于无菌体液标本无菌体液是指除血液、骨髓和脑脊液外的羊膜腔液、后穹窿穿刺液、透析液、心包液、腹膜穿刺液和滑膜液，正常的穿刺液是无菌的，在感染的情况下，只要检出细菌，通常都可视为病原菌。无菌体液标本采集指征局部组织或器官怀疑有细菌感染，应进行细菌培养。无菌体液标本采集方法由临床医生按相应规程无菌采取适量标本送检。当留取标本时，为防止无菌体液凝固，应在无菌容器内先加入灭菌肝素0.5mg（可抗凝5ml标本），再注入各种穿刺液，轻轻混合。肉汤管和血培养瓶可以直接注入标本并混匀，无需抗凝，标本与培养基之比为15110。脓液关于脓液标本组织或器官的化脓性感染，其病原菌的来源可分为两类：内源性（感染源是炎症局部周围器官中的正常菌群）和外源性（感染源是存在于外界的微生物）。采集指征局部组织或器官有化脓性感染表现，应进行细菌培养。脓液标本采集方法开放脓肿 用无菌盐水或70酒精擦去表面渗出物，用拭子深入溃疡基底部或边缘部，采集两个拭子，分别做培养和革兰染色，也可对渗出物做需氧培养。开放病灶不能做厌氧培养。闭合脓肿 不能用拭子，要消毒脓肿表面皮肤后用无菌注射器抽取，注入无菌试管中送检。烧伤伤口 清创，出现渗出物后用拭子用力采集，仅做需氧培养。也可送组织标本。脓疱或水疱 酒精消毒，干燥，用针头（小儿用23号针头）挑破脓疱，用拭子采集脓疱液和基底部标本。脓液标本采集注意事项对大多数开放伤口，采集前应先清创，去除表面菌群。除非有渗出物，干燥、结痂伤口一般不做培养。闭合脓肿应取穿刺物和脓肿壁标本。开放脓肿处理同开放伤口。不要仅仅送检脓液，应在病灶活动区域或基底部采集标本，最好是组织标本。脓液标本采集标本运送和验收标本采集后应尽快送检，如果在1h内不能培养，应将标本冷藏。标本验收与拒收:标本拭子未装入无菌容器内或注射器渗漏污染者，送检时间过长者应拒收。标本涂片革兰染色若发现上皮细胞，提示标本已被污染，一般不适合再做培养。生殖道标本关于生殖道标本生殖道标本的细菌学检验是协助诊断生殖道感染的重要手段。生殖器官标本中常见的病原菌有葡萄球菌、肠球菌、链球菌、酵母样菌、淋病奈瑟菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阴道加德纳菌等。生殖道标本采集指征怀疑有生殖道细菌感染，应进行细菌培养。生殖道标本采集方法应由临床医师采集，收集于无菌试管内送检。淋球菌检查时，不论男女尿道及子宫颈均需用拭子插入尿道及子宫颈3cm深取样送检，女性要避免受阴道分泌物污染。生殖道标本采集方法男性标本如疑为急性淋病奈瑟菌或其他化脓性细菌感染应在清洗龟头部后,以碘伏或其他非粘膜刺激性消毒剂消毒后,挤出分泌物立即以无菌棉拭子采取,立即送检,或以专用的细拭子插入尿道口12 cm ,旋转采取。如疑为前列腺炎、精囊炎或慢性淋病奈瑟菌感染应由医师按摩前列腺,以无菌手续自尿道口采取前列腺液送检。生殖道标本采集方法女性标本成年妇女自宫颈采取标本,应在扩阴器的支持下,选取有炎症或分泌物部位,先以无菌棉拭子拭去表浅层分泌物,再用另一拭子取宫颈分泌物送检。如做厌氧或真菌培养应另外采取标本。如怀疑淋球菌感染，可以同时另外采集一份肛门拭子标本。如未成年幼女疑患性传播疾病时,不应使用扩阴器,应以无菌拭子在阴道口处采取分泌物送检。生殖道标本采集运送和验收标本采集后应置于无菌试管内尽快送检，禁止冷藏。标本验收与拒收:未置于无菌容器内、淋球菌检查置于冰箱保存或未及时送检者应拒收。由于可能受其他形态相似的细菌干扰，阴道和宫颈标本一般不做革兰染色查淋球菌。临床微生物标本的安全性管理所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作、防止污染被污染的原则下进行。执行标本采集的所有步骤都必须戴手套、穿试验服（工作服），需要的话，戴防护口罩和防护眼镜。所有的原始标本都应置于防漏、密闭的容器中，在转运中应置于防漏、可封口的塑料袋中，容器和塑料袋都应有一个标明标本信息的文字部分。临床微生物标本的安全性管理不能将带针头的注射器直接送检，其内容物应移至无菌管内或用保护性装置移去针头，重新盖上盖并置于密封、防漏的塑料袋中。不能将泄漏的标本容器转运至实验室或进行处理。如需继续进行处理，要通知医生容器的泄漏的情况，解释可能对结果带来偏差，并要求重新送检。新标本采集后则对泄漏的标本进行高压灭菌，并丢弃。谢谢！微生物室(83304616-60662)