8.3 食品中常规项目的微生物检验食品中常规项目的微生物检验食品中菌落总数的测定食品中菌落总数的测定菌落总数的定义菌落总数的定义菌落总数：是指食品检样经过处理，在一菌落总数：是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得定条件下培养后，所得1g1g或或1mL1mL或或1cm1cm2 2表表面积检样中所含细菌菌落的总数。面积检样中所含细菌菌落的总数。 测定原理：测定原理：菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分，培养温度和时间，下培养后（如培养基成分，培养温度和时间，PHPH，需氧性质等），所得，需氧性质等），所得1ml (g) 1ml (g) 检样中所含检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在培养琼脂上生长的嗜中温性果，只包括一群在培养琼脂上生长的嗜中温性需氧的菌落总数。菌落总数主要作为判定食品需氧的菌落总数。菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。行卫生学评价时提供依据。 一、实验目的一、实验目的1 1、学习或均技术的技术方法；、学习或均技术的技术方法；2 2、掌握食品细菌总数的测定报告方式。、掌握食品细菌总数的测定报告方式。二、实验材料二、实验材料1 1、电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、托、电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、托盘天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻盘天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试管架、酒精灯、均质璃珠、平皿、试管、试管架、酒精灯、均质器或乳钵、灭菌刀或剪刀、灭菌镊子、器或乳钵、灭菌刀或剪刀、灭菌镊子、75%75%酒酒精棉球、玻璃蜡笔、登记薄精棉球、玻璃蜡笔、登记薄2 2、培养基和试剂：、培养基和试剂：75%75%乙醇、生理盐水、乙醇、生理盐水、15%15%氢氧化钠溶液、营养琼脂培养基氢氧化钠溶液、营养琼脂培养基实验二实验二 食品中细菌总数的测定食品中细菌总数的测定1 1、检验程序、检验程序菌落总数检验程序菌落总数检验程序： 检检样样做做成成几几个个适适当当倍倍数数的的稀稀释释液液选选择择2-32-3个个适适宜宜稀稀释释度度各各以以1ml1ml之之量量分分别别入入灭灭菌菌平平皿皿内内每每皿皿内内加加入入46460 0C C适量营养琼脂适量营养琼脂菌落数菌落数报告报告三、实验方法三、实验方法（1 1）以以无无菌菌操操作作，将将检检样样25g25g（或或25ml25ml）剪剪碎碎以以后后，放放于于含含有有225ml225ml灭灭菌菌生生理理盐盐水水或或其其他他稀稀释释液液的的灭灭菌菌玻玻璃璃瓶瓶内内（瓶瓶内内预预先先置置适适当当数数量量的的玻玻璃璃珠珠）或或灭灭菌菌乳乳钵钵内内，经经充充分分振振摇摇或或研研磨做成磨做成1 1：1010的均匀稀释液。的均匀稀释液。 固固体体检检样样在在加加入入稀稀释释液液后后，最最好好置置灭灭菌菌均均质质器器中中以以8000r/min100000r/min8000r/min100000r/min的的速速度度处处理理1min1min，做做成成1 1：1010的的均均匀匀稀释液。稀释液。（2 2）用用1ml1ml灭灭菌菌吸吸管管吸吸取取1 1：1010稀稀释释液液1ml1ml，沿沿管管壁壁徐徐徐徐注注入入含含有有9ml9ml灭灭菌菌生生理理盐盐水水或或其其他他稀稀释释的的试试管管内内（注注意意吸吸管管尖尖端端不不要要触触及及管管内内稀稀释释液液，下下同同），振振摇摇试试管管混混合合均均匀匀，做做成成1 1：100100的稀释液。的稀释液。（3 3）另另取取1ml1ml的的灭灭菌菌吸吸管管，按按上上项项操操作作顺顺序序作作1010倍倍递递增增稀稀释释液，如此每递增稀释一次，即换用液，如此每递增稀释一次，即换用1 1支支1ml1ml灭菌吸管。灭菌吸管。2 2、检样稀释及培养检样稀释及培养（4 4）根根据据食食品品卫卫生生标标准准要要求求或或对对检检样样污污染染情情况况的的估估计计，选选择择2 23 3个个适适宜宜稀稀释释度度，分分别别在在作作1010倍倍递递增增稀稀释释的的同同时时，即即以以吸吸取取该该稀稀释释度度的的吸吸管管移移1ml1ml稀稀释释液液于于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。（5 5）稀稀释释液液移移入入平平皿皿后后，应应及及时时将将凉凉至至46460 0C C营营养养琼琼脂脂培培养养基基 可可放放置置在在（461461）0 0C C）水水浴浴锅锅内内保保温温 注注入入平平皿皿15ml15ml20mL20mL，并并转转动动平平皿皿使使混混合合均均匀匀，同同时时将将营营养养琼琼脂脂培培养养基基倾倾入入加加有有1ml1ml稀稀释释液液（不不含含样样品品）的灭菌平皿内作空白对照。的灭菌平皿内作空白对照。 （6 6）等琼脂凝固后，翻转平板，置（）等琼脂凝固后，翻转平板，置（361361）0 0C C恒恒温箱内培养（温箱内培养（482482）h h取出，计算平板内菌落数目取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得乘以倍数，即得1g1g（1mL1mL）样品所含菌落总数。）样品所含菌落总数。 3 3、菌落计算方法、菌落计算方法（1 1）菌落计数方法）菌落计数方法 做做平平板板菌菌落落计计数数时时，可可用用肉肉眼眼观观查查，必必要要时时用用放放大大镜镜检检查查，以以防防遗遗漏漏。在在记记下下各各平平板板的的菌菌落落数数后后，求求出出同同稀稀释释度的各平板平均菌落总数。度的各平板平均菌落总数。（2 2）菌落计数的报告）菌落计数的报告平板菌落数的选择平板菌落数的选择 选取菌落数在选取菌落数在3030300300之间的平板作为菌落总数测定标之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘即可计算半个平板后乘2 2以代表全皿菌落数。平皿内如有链以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。条链作为一个菌落计。 稀释度的选择稀释度的选择 应应选选择择平平均均菌菌落落数数在在3030300300之之间间的的稀稀释释度度，乘乘以以稀稀释释倍倍数数报报告告之之。若若有有两两上上稀稀释释度度，其其生生长长的的菌菌落落数数均均在在3030300300之之间间，则则视视两两者者之之比比如如何何来来决决定定。若若其其比比值值小小于于或或等等于于2 2，应应报报告告其其平平均均数数；若若大于大于2 2则报告其中较小的数字。则报告其中较小的数字。 若若所所有有稀稀释释度度平平均均菌菌落落数数均均大大于于300300，则则应应按按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 若若所所有有稀稀释释度度的的平平均均菌菌落落数数均均小小于于3030，则则应应按按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 若若所所有有稀稀释释度度均均无无菌菌落落生生长长，则则以以小小于于1 1乘乘以以最低稀释倍数报告之。最低稀释倍数报告之。 若所有稀释度的平均菌落数均不在若所有稀释度的平均菌落数均不在3030300300之之间，其中一部分大于间，其中一部分大于300300或小于或小于3030时，则以最接近时，则以最接近3030或或300300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。菌落数的报告菌落数的报告 菌落数在菌落数在100100以内时，按其实有数报告，大于以内时，按其实有数报告，大于100100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用面的零数，也可用1010的指数来表示。的指数来表示。食品中大肠菌群的测定食品中大肠菌群的测定大肠菌群的定义大肠菌群的定义:大肠菌群并非细菌学分类命大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清血清学方面并非完全一致，其学方面并非完全一致，其定义为：定义为：需氧及需氧及兼性厌氧、在兼性厌氧、在3724 h3724 h能分解乳糖产酸、产气、能分解乳糖产酸、产气、需氧和兼性厌的革兰氏阴性无芽胞杆菌。需氧和兼性厌的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群大肠菌群= =大肠杆菌吗？大肠杆菌吗？大肠菌群包括大肠杆菌。大肠菌群指能大肠菌群包括大肠杆菌。大肠菌群指能够发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴型无芽够发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴型无芽孢杆菌。孢杆菌。大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌(E. coli)(E. coli)习惯称为大肠杆习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。属。大肠菌群的卫生意义大肠菌群的卫生意义大大肠菌群数的高低，表明了菌群数的高低，表明了粪便便污染的程染的程度，也反映了度，也反映了对人体健康危害性的大小。人体健康危害性的大小。食品中有食品中有粪便便污染，染，则可以推可以推测该食品中食品中存在着存在着肠道致病菌道致病菌污染的可能性，潜伏着染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威食物中毒和流行病的威胁，必，必须看作看作对人人体健康具有潜在的危体健康具有潜在的危险性。性。 国标法国标法国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。试验、分离培养和证实试验。乳糖乳糖发酵酵试验：样品稀品稀释后，后，选择三个稀三个稀释度，度，每个稀每个稀释度接种三管乳糖胆度接种三管乳糖胆盐发酵管。酵管。361361培培养养242h242h，观察是否察是否产气。气。 分离培养：分离培养：将将产气气发酵管培养物酵管培养物转种于伊种于伊红美美蓝琼脂平板上，脂平板上，361361培养培养18-24h18-24h，观察菌落形察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，挑取平板上的可疑菌落，进行革行革兰氏氏染色染色观察。同察。同时接种乳糖接种乳糖发酵管酵管361361培养培养242h242h，观察察产气情况。气情况。 报告：告：根据根据证实为大大肠杆菌阳性的管数，杆菌阳性的管数，查MPNMPN表，表，报告每告每100ml100ml（g g）大）大肠菌群的菌群的MPNMPN值。 实验三实验三 食品中大肠菌群的测定食品中大肠菌群的测定一、实验目的一、实验目的1 1、学习食品中大肠菌群检测程序、方法；、学习食品中大肠菌群检测程序、方法；2 2、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。二、实验材料二、实验材料1 1、设备和材料、设备和材料温温箱箱、水水浴浴锅锅、天天平平、显显微微镜镜、均均质质器器或或乳乳钵钵、温温度度计计、平平皿皿、试试管管、发发酵酵管管、吸吸管管、载载玻玻片片、接接种种针针2 2、培养基及试剂、培养基及试剂乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管、乳乳糖糖发发酵酵管管、蛋蛋白白胨胨水水、靛靛基基质质试试剂剂、麦麦康康凯凯、伊伊红红美美蓝蓝琼琼脂脂（EMBEMB）、远远腾腾氏氏琼琼脂、革兰氏染色液脂、革兰氏染色液三、实验方法与三、实验方法与步骤步骤1 1、采样及稀释、采样及稀释以以无无菌菌操操作作将将检检样样25g25g（或或25ml25ml）放放于于含含有有225ml225ml灭灭菌菌生生理理盐盐水水或或其其他他稀稀释释液液的的灭灭菌菌玻玻璃璃瓶瓶内内（瓶瓶内内预预置置适适当当数数量量的的玻玻璃璃珠珠）或或灭灭菌菌乳乳钵钵内内，经经充充分分振振摇摇或或研研磨磨做做成成1 1：1010的的均均匀匀稀稀释释液液。固固体体检检样样最最好好用用无无菌菌均均质质器器，以以8000r/min8000r/min10000r/min10000r/min的的速速度度处处理理1min1min，做成做成1 1：1010的稀释液。的稀释液。用用1ml1ml灭灭菌菌吸吸管管吸吸取取1 1：1010稀稀释释液液1ml1ml，注注入入含含有有9ml9ml灭灭菌菌生生理理盐盐水水或或其其他他稀稀释释液液的的试试管管内内，振振摇摇混混匀匀，做做成成1 1：100100的的稀稀释释液液，换换用用1 1支支1ml1ml灭灭菌菌吸吸管管，按按上上述述操操作依次作作依次作1010倍递增稀释液倍递增稀释液根根据据食食品品卫卫生生要要求求或或对对检检验验样样品品污污染染情情况况估估计计，选选择择三三个个稀稀释释度度，每每个个稀稀释释度度接接种种3 3管管。也也可可直直接接用用样样品接种。品接种。2. 2. 乳糖初发酵试验乳糖初发酵试验 即即通通常常所所说说的的假假定定试试验验。其其目目的的在在于于检检查查样样品品中中有无发酵乳糖产生气体的细菌。有无发酵乳糖产生气体的细菌。 将将待待检检样样品品接接种种于于乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管内内，接接种种量量在在1ml1ml以以上上者者，用用双双料料乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管；1ml1ml及及1ml1ml以以下下者者，用用单单料料乳乳糖糖发发酵酵管管。每每一一个个稀稀释释度度接接种种3 3管管，置置（361361）0 0C C温温箱箱内内，培培养养（242242）h h，如如所所有有乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管都都不不产产气气，则则可可报报告告为为大大肠肠菌菌群群阴阴性性，如如有产生者，则按下列程续进行有产生者，则按下列程续进行 将将产产气气的的发发酵酵管管分分别别转转种种在在伊伊红红美美蓝蓝琼琼脂脂板板或或麦麦康康凯凯琼琼脂脂平平板板上上，置置（361361）0 0C C温温箱箱内内，培培养养18h 18h 24h24h，然然后后取取出出，观观察察菌菌落落形形态态并并作作革革兰兰氏氏染染色色镜镜检和复发酵试验。检和复发酵试验。 即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。 在在上上述述的的选选择择性性培培养养基基上上，挑挑取取可可疑疑大大肠肠菌菌群群1 1 2 2个个进进行行革革兰兰氏氏染染色色，同同时时接接种种乳乳糖糖发发酵酵管管，置置（361361）0 0C C的的温温箱箱内内培培养养（242242）h h，观观察察产产气气情情况。况。 凡凡乳乳糖糖发发酵酵管管产产气气，革革兰兰氏氏染染色色为为阴阴性性无无芽芽胞胞杆杆菌菌，即即报报告告为为大大肠肠杆杆菌菌阳阳性性；凡凡乳乳糖糖发发酵酵管管不不产产气气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。5.5.报告报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPNMPN检索表，检索表，报告每报告每100ml100ml（g g）食品中大肠菌群的最可能数。）食品中大肠菌群的最可能数。 粪大肠菌群的检验粪大肠菌群的检验 根据国家颁布的食品卫生微生物检验标准方法根据国家颁布的食品卫生微生物检验标准方法(GB4789.3-1994)，粪大肠菌群系指一群能在，粪大肠菌群系指一群能在44 24h内发酵乳糖产酸产气和利用色氨酸产内发酵乳糖产酸产气和利用色氨酸产生靛基质，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽生靛基质，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。表孢杆菌。表8-3中的大肠艾希氏菌中的大肠艾希氏菌I型即属粪大型即属粪大肠菌群。粪大肠菌群的唯一来源是粪便，因此，肠菌群。粪大肠菌群的唯一来源是粪便，因此，唯有粪大肠菌群是粪便污染的确切指标。在被唯有粪大肠菌群是粪便污染的确切指标。在被检样品中，如果有粪大肠菌群存在，则在大肠检样品中，如果有粪大肠菌群存在，则在大肠菌群检验中也被计入。因此，也有将大肠菌群菌群检验中也被计入。因此，也有将大肠菌群数称为总大肠菌群数者。数称为总大肠菌群数者。沙门氏杆菌的检验沙门氏杆菌的检验沙门氏杆菌是一群形态和培养特性都类似的肠沙门氏杆菌是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一个大属，也是肠杆菌科中最重要杆菌科中的一个大属，也是肠杆菌科中最重要的病原属，它包括将近的病原属，它包括将近2 000个血清型。沙门个血清型。沙门氏菌病常在动物中广泛传播，人的沙门氏菌感氏菌病常在动物中广泛传播，人的沙门氏菌感染和带菌也非常普遍。由于动物的生前感染或染和带菌也非常普遍。由于动物的生前感染或食品受到污染，均可使人发生食物中毒。世界食品受到污染，均可使人发生食物中毒。世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位。沙门氏菌常作为进出口食品和其位或第二位。沙门氏菌常作为进出口食品和其他食品的致病菌指标。因此，检查食品中的沙他食品的致病菌指标。因此，检查食品中的沙门氏菌极为重要。门氏菌极为重要。 志贺氏杆菌的检验志贺氏杆菌的检验志贺式菌属的细菌通称为痢疾杆菌，是细菌性志贺式菌属的细菌通称为痢疾杆菌，是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原微生物很多，如志贺氏菌属、沙门氏菌属、变微生物很多，如志贺氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、艾希氏菌属等，还有阿米巴原虫、形杆菌属、艾希氏菌属等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志鞭毛虫及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对志贺氏菌的易感性较高，所以在食物和饮用水的贺氏菌的易感性较高，所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏菌作为指标。卫生检验时，常以是否含有志贺氏菌作为指标。 志贺氏菌属是由四个亚群组成，即志贺氏菌属是由四个亚群组成，即A、B、C、D四个亚群。四个亚群。致病性葡萄球菌的检验致病性葡萄球菌的检验典型的葡萄球菌呈球形，直径典型的葡萄球菌呈球形，直径 m；致病性；致病性葡萄球菌一般较非致病性菌小，且各个菌体的葡萄球菌一般较非致病性菌小，且各个菌体的大小及排列也较整齐。细菌繁殖时呈多个平面大小及排列也较整齐。细菌繁殖时呈多个平面的不规则分裂，堆积成为葡萄串状排列。在液的不规则分裂，堆积成为葡萄串状排列。在液体培养基中生长，常呈双球或短链状排列，易体培养基中生长，常呈双球或短链状排列，易误认为链球菌。葡萄球菌无鞭毛及芽孢，一般误认为链球菌。葡萄球菌无鞭毛及芽孢，一般不形成荚膜，易被碱性染料着色，革兰氏染色不形成荚膜，易被碱性染料着色，革兰氏染色阳性，当衰老、死亡或被白细胞吞噬后常转为阳性，当衰老、死亡或被白细胞吞噬后常转为革兰氏阴性，对青霉素有抗药性的菌株也为革革兰氏阴性，对青霉素有抗药性的菌株也为革兰氏阴性。兰氏阴性。