RNA电泳理想结果电泳理想结果RNA电泳理想结果电泳理想结果实验六实验六 PCR反应反应 PCR的过程：的过程：q高温变性：高温变性：将反应体系置于高温下变性，使双链将反应体系置于高温下变性，使双链DNA解链为两单链解链为两单链一、实验目的一、实验目的 了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。二、实验原理二、实验原理 PCR技术是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA的某个特殊区域扩增出来的技术。q低温退火：低温退火：引物与模板链结合，形成部分双链引物与模板链结合，形成部分双链DNAq中温延伸中温延伸：Taq DNA聚合酶使引物从聚合酶使引物从5端向端向3端延伸，端延伸，4种种dNTP掺入合成新的掺入合成新的DNA互补链互补链q反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。序列以指数形式扩增。三、实验材料三、实验材料 实验二所提质粒pET-cam5。 （请先按如下步骤操作：取（请先按如下步骤操作：取0.5l0.5l实验二抽提的质粒置于实验二抽提的质粒置于一一PCRPCR管，加入管，加入19.5l19.5l灭菌蒸馏水，混匀后作为这次灭菌蒸馏水，混匀后作为这次PCRPCR实验用实验用DNADNA模板模板) )四、试剂四、试剂qrTaq 酶、10 x PCR bufferqdNTP mixtrures (10mM)q前向引物 (P1) (10uM)q反向引物 (P2) (10uM) q1.0% 琼脂糖凝胶 五、实验步骤五、实验步骤1、PCR反应混合液的配制反应混合液的配制 (50l) 10 x PCR buffer 5l dNTP mixture 4l 前向引物P1 2l 反向引物P2 2l 模板DNA 0.1l rTaq酶 0.5l 所有试剂按量仔细添加按量仔细添加按量仔细添加按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，最后添加20l矿物油。 去离子水 36.4l2、PCR仪的参数设置仪的参数设置 94 4 min 94 4 min 94 30sec 94 30sec 62 30sec 62 30sec 72 20sec 72 20sec 72 5 min 72 5 min3 3、琼脂糖凝胶电泳检测、琼脂糖凝胶电泳检测 40 40 cyclecycles s 反应结束后，取5l PCR产品，加入1l 6 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min。 其余其余45 5l PCR产品保存在产品保存在-20冰箱中，下次实验使用冰箱中，下次实验使用。PCR的结果的结果