第二章第二章 原核微生物的基因表达与操作原核微生物的基因表达与操作2.1 2.1 原核微生物的基因表达及其调控原核微生物的基因表达及其调控2.2 2.2 原核微生物的基因表达产物的分离纯原核微生物的基因表达产物的分离纯化化 （1 1）转录因素；）转录因素； （2 2）翻译因素；）翻译因素； （3 3）蛋白质的稳定性；）蛋白质的稳定性； （4 4）胞外分泌的特性）胞外分泌的特性一、原核生物的基因表达一、原核生物的基因表达第一节第一节 原核生物的基因表达与调控因素原核生物的基因表达与调控因素（一）、转录对基因表达的影响（一）、转录对基因表达的影响要注意的关键名词术语:1)编码链（有义链，thecodingstrand）;6)转录单位（Atranscriptionunit）;2)反义链（模板链，thetemplatestrand）;7)上游（Upstream）;3)RNA聚合酶（RNApolymerase）;8)下游（Downstream）;4)启动子（Apromoter）;9)转录起始位点(Startsite);5)终止子（Aterminator）;10)初始转录产物Aprimarytranscript新生新生RNARNA序列与模板链序列与模板链互补；与编码链相同。互补；与编码链相同。 原核生物原核生物原核生物原核生物RNARNARNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 大肠杆菌提取的大肠杆菌提取的RNARNA聚合酶：由聚合酶：由五个亚基组成五个亚基组成，分子量为，分子量为 500 500 kDakDa。 核心酶（核心酶（ 2）：）：转录功能单位转录功能单位 全酶（全酶（ 2 2 ） （core enzymecore enzyme） （holoenzymeholoenzyme） 因子因子：参与识别特异的启动子：参与识别特异的启动子 原核生物原核生物RNARNA聚合酶能被聚合酶能被利福平（利福平（rifampicinrifampicin）所抑制所抑制。 利福平与利福平与亚基相结合，从而抑制酶的活性。亚基相结合，从而抑制酶的活性。RNARNA聚合酶可聚合酶可形成形成1 1个中间个中间管道管道( (二二) )、原核生物基因的翻译原核生物基因的翻译起始因子Initiation factors (IFs) 可稳定自由状态的 30S 亚基；以及结合起始 tRNA到 30S-mRNA复合物上二、二、 可调控启动子驱动的基因表达可调控启动子驱动的基因表达 微生物表达系统：微生物表达系统： （1 1）功能基因；）功能基因； （2 2） 载体；载体； （3 3） 受体菌：受体菌：大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌 其它细菌受体菌其它细菌受体菌 酵母菌酵母菌 昆虫细胞昆虫细胞 哺乳动物细胞等哺乳动物细胞等 E. coliE. coli用作受体菌的优势：用作受体菌的优势： （1 1）对其遗传学背景、分子生物学、生物化学和生）对其遗传学背景、分子生物学、生物化学和生 理学方面的了解较为深入；理学方面的了解较为深入； （2 2）很多目的基因能在）很多目的基因能在E. coliE. coli中迅速而有效地表达；中迅速而有效地表达； （3 3）其培养条件易于掌控，培养费用相对较低。）其培养条件易于掌控，培养费用相对较低。 启动子：DNA分子中与RNA pol I发生特定结合的序列，启动转录过程。 启动子有强/弱之分。 E. coli的启动子： （1）-10 region：TATA box（Pribnow box） T77A76T60A61A56T82 （2）-35 region：为RNA pol I初始结合区。 T69T79G61A56C54A54 非调控启动子：对细胞产生伤害 (1) 持续性地高水平表达某一目的基因会过分消耗宿 主细胞的营养和能源，最终造成致死效应; (2) 由于使宿主细胞处于生长的逆境，容易发生载体 质粒的丢失； (3) 非调控性地表达外源蛋白，容易受到蛋白酶的水 解作用，从而使最终的蛋白量并不高； (4) 形成不溶性的包含体蛋白。（一）可调控启动子一）可调控启动子(Regulatable Promoters)： 大肠杆菌中已开发5种可调控启动子 (1) Plac 启动子：即 E. coli lac启动子; (2) Ptrp 启动子：即 E. coli trp启动子； (3) Ptac 启动子：由启动子：由lac和和trp组成的杂合启动子。组成的杂合启动子。 即即 E. coli lac (-10 区) E. coli trp (-35 区) (4) PL 启动子：基于噬菌体 的启动子； (5) Pt7 启动子：噬菌体T7 的基因10启动子 可调控启动子的特征： （1）通过与阻遏蛋白的相互作用，提供一个 开关系统，使启动子能在特定条件下发 生关闭或者开放； （2）容易被大肠杆菌的RNA聚合酶全酶所识 别。四种简单类型控制通路四种简单类型控制通路 诱导作用是指存在诱导物能使阻遏蛋白失活，或者可激活一个激活蛋白而解除阻遏蛋白对转录起始过程的阻遏； 阻遏作用是指一个辅阻遏物激活一种阻遏蛋白，或者使一种激活蛋白失活而对转录过程发生阻遏作用。 lac 启动子：（1）lac启动子来源于大肠杆菌的乳糖操纵子，包括启动子、活化蛋白（catabolite activator protein, CAP）结合位点、操纵基因和lacZ组成。（2） lac启动子受到阻遏蛋白（repressor）的负调控，而受到CAP和cAMP的正调控。其中CAP的正调控是通过增加启动子与RNA聚合酶的亲和性而起作用。 (3) lac 启动子由于与阻遏蛋白相结合而处于关闭状态，但当加入乳糖或者半乳糖苷结构类似物，如异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、硫甲基半乳糖苷（TMG）和邻硝基苯基半乳糖苷（ONTG）后可发生脱阻遏作用。乳糖操纵子基因产物:1) lacI: 阻遏蛋白; 2) lacZ：-半乳糖苷酶；3) lacY：透性酶;4) lacA：硫代半乳糖苷转乙酰基酶 cAMP参与乳糖操纵子的调控：（1）cAMP通过与cAMP受体蛋白（CRP）结合，引起CRP构 象变化，形成一种有活性的cAMP-CRP复合物；（2）乳糖操纵子启动基因（O）有2个位点：一个与RNA聚合 酶结合；另一个与cAMP-CRP结合，而且只有后者结合 后才能与启动基因结合，启动转录过程；（3）cAMP-CRP复合物不仅可以与一个启动基因结合，而且 还可以与几个操纵子上的启动基因结合，从而影响到许 多操纵子。Glucose reduces CRP activiyCRP复合物形成促进复合物形成促进RNA聚合酶与启动子聚合酶与启动子的结合的结合当当CAPCAP与与cAMPcAMP协同作用时，其对启动子的亲和性发生增强，而此时如果葡协同作用时，其对启动子的亲和性发生增强，而此时如果葡萄糖的量达到最低时，其亲和性最高。这样，当诱导物存在时，高浓度的萄糖的量达到最低时，其亲和性最高。这样，当诱导物存在时，高浓度的cAMPcAMP水平能够导致乳糖操纵子的启动子发生高水平的转录作用。水平能够导致乳糖操纵子的启动子发生高水平的转录作用。trp promoter色氨酸启动子色氨酸启动子 由色氨酸阻遏蛋白进行调控：正调控作用。可形成启动子-阻遏蛋白复合物。 trp 启动子的脱阻遏可通过： （1）移除色氨酸； （2）加入色氨酸结构类似物，如吲哚丙烯酸（ 3-indoleacrylic acid）.3-吲哚丙烯酸 色氨酸操纵子（色氨酸操纵子（trp operon） 由启动子、衰减子、操纵基因和色氨酸合成的5种酶组成。 （1）由trpR产生的阻遏蛋白只有在与色氨酸结合后才能形成有活性的阻遏蛋白，它可以与操纵基因结合从而阻止转录的起始。当色氨酸缺乏时，该阻遏蛋白的前体不能与操纵基因结合，也就不能发挥阻遏作用； （2）当细胞中的色氨酸浓度较高时，在衰减子的作用下，操纵子DNA形成类似终止子的茎环结构茎环结构，从而只能翻译出14肽，称为前导肽。IAA是色氨酸的结构竞争类似物，它可以与阻遏蛋白结合而使其失去阻遏活性；不能再与操纵基因结合，从而不能阻遏转录过程。 P Ptactac 启动子启动子： 是来自于lac和trp的一组杂合启动子，但是比lac和trp都强得多，是一组强启动子。包括： （1） PtacI：PlacUV5的-10区 Ptrp的-35区； （2） PtacII：Ptrp的-35区（一段合成的包括Pribnow框在 内的46bp的DNA） Plac的操纵基因； （3） Ptac12：Plac的-10区 Ptrp的-35区 所有所有Ptac都受都受IPTG的诱导，同时受到阻遏蛋白的阻遏调控。的诱导，同时受到阻遏蛋白的阻遏调控。 PL 启动子： 阻遏蛋白: cI，来源于噬菌体 . cI857 : 为 cI温度敏感突变体. (1) 将携带敏感的cI857 的细菌细胞首先在28 to 30 C条件下 培养，此时cI857 阻遏PL启动子的转录； (2) 当细菌细胞被培养至特定浓度时（一般是到达平衡 期），将培养温度升高至42 C, 此时cI857 不再发生阻 遏作用，PL启动子开始启动转录过程。 PL为为 噬菌体左向早期启动子，控制基因从噬菌体左向早期启动子，控制基因从N到到att的早期转录，受的早期转录，受到到cI所编码的阻遏蛋白的调控。所编码的阻遏蛋白的调控。 噬菌体左向操纵子结构示意图噬菌体左向操纵子结构示意图P PL L 启动子启动子( (二二) )、常用原核表达载体、常用原核表达载体 大量产物的获得： （1）强的、可调控的启动子； （2）翻译效率； （3）新生肽稳定性等。 mRNA与核糖体的结合能力： （1）RBS与翻译起始密码子（AUG）之间的距离要合适； （2）编码从结合位点到起始几个密码子之间的的DNA序 列不应含有可能形成环状结构的序列，否则会妨碍 与核糖体的结合。优良表达载体的性能优良表达载体的性能 （1 1）强转录启动子和终止子；）强转录启动子和终止子； （2 2）核糖体结合位点（）核糖体结合位点（RBSRBS）的强弱；的强弱； （3 3）质粒载体及其质粒的拷贝数；是否整合到）质粒载体及其质粒的拷贝数；是否整合到 染色体染色体DNADNA之上；之上； （4 4）合成的外源蛋白在细胞中的定位；）合成的外源蛋白在细胞中的定位； （5 5）宿主的翻译效率；）宿主的翻译效率； （6 6）克隆载体所表达的外源蛋白的稳定性。）克隆载体所表达的外源蛋白的稳定性。 1、含、含lac 启动子的表达载体：启动子的表达载体： 多种。其最大的特点是带有编码lacZ（-半乳糖苷酶）的编码序列。 当外源基因插入后，如果能够保持正确的ORF，就可以形成由外源基因编码的多肽和-半乳糖苷酶组成的融合蛋白。 所有含lac启动子的表达载体都受到IPTG的诱导。 pOP203-13特点（1）为pBR322衍生质粒，插入 了强启动子PlacUV5并在其下 游加入了-半乳糖苷酶的 编码序列（ -gal）21 bp 片断和一个EcoRI位点；（2）其融合蛋白的N端为-半乳 糖苷酶的前7个氨基酸和 EcoRI接头编码的少数几个 氨基酸，其C端为完整的外 源蛋白。pOP203系列表达载体：A family of cloning vectors containing the lacUV5PromoterpOP203-1,2,3、pOP203-13、pOP203-24、pOP203-27、pOP203-28、pOP203-29表达载体表达载体pOP203pOP203质粒结构示意图质粒结构示意图 2 2、含、含trptrp 启动子的表达载体：启动子的表达载体： （1）产生的表达蛋白的量高于lac启动子； （2）所有含trp启动子的表达载体都受到3-吲哚丙烯 酸（IAA）的诱导。 如：pDR720pDR720 质粒质粒pDR720是一个含是一个含trp启动子的表达载体，它启动子的表达载体，它来源于来源于p51，trp启动子在启动子在Sma I位点插入，在启动子位点插入，在启动子的下游有的下游有3个位点，个位点，Sal I、BamH I和和Sma I，可以插，可以插入外源基因。入外源基因。质粒载体pDR720结构示意图 3、含tac 启动子的表达载体： 高表达效率启动子；受IPTG的诱导。 多种商业化的载体。如： pKK223-3; pBADHis-A, B, C; pTrcHis-A, B, C; pSE420 特点：特点：1）Ampr；2）tac启动子；3）lacZ核糖体结合部位；4）ATG起始密码子，位于 RBS下游8bp处；5）来源于-噬菌体的终止 子T1和T2，以避免其它 基因的过度转录。 4、含PL 启动子的表达载体： 是一种极强的启动子，所以被广泛用于各种载体的 构建； 如：pPL- ; （1）来源于pBR322, pBR322的EcoRI/BamHI位点 被PL 和N基因取代； （2）外源基因可以插入到N基因中的HpaI位点； （3）当培养温度为29-31C时，PL启动子处于阻遏 状态；但当温度升到42C，发生脱阻遏。质粒载体质粒载体pPL- 结构示意图结构示意图（三）提高蛋白质的表达量三）提高蛋白质的表达量 某些表达载体被构建用于增加蛋白质的表达量，例如，pPLc2833 : （1）强启动子； （2）选择性标记； （3）多克隆位点（MCS） 其衍生质粒pCP3的构建：将pPLc2833的复制起始位点替换为另一个质粒pKN402。 质粒pKN402的复制起始位点是耐温型的，在42C时仍然有很强的复制起始的功能。电泳后回收片段c电泳后回收片段1和3连接 由于pKN402和pCP3的复制子在42C时仍然具有很强的起始复制能力，因此当培养温度升高到42C时，细胞中的pKN402和pCP3的拷贝数要比pPLc2833高510倍。温度对3种表达载体质粒拷贝数的影响（四）大规模培养系统四）大规模培养系统 小规模培养（15L）含表达载体的重组菌株时，其调控可以直接向培养基中添加诱导物，或者升高温度，但是在半工业化（20200L）或者工业化大规模（大于200L）生产时，不能采用小规模的方法： （1）直接向培养基中添加诱导物如IPTG，由于需要量较大，成本 高，不经济； （2）即使是使用温度敏感的表达载体，升高温度既需要较长的时 间，又需要很大的能源消耗，成本也很高。 一种解决的途径：使用“双质粒系统双质粒系统”：用trp启动子带动编码cI阻遏蛋白的基因，然后将它们置于一个弱启动子的载体上；将要表达的外源基因置于强启动子PL之下，使其受PL启动子的控制。“双载体系统”特点：1）当培养基中Trp含量较低时，trp启动子启动，cI阻遏蛋白合成，此时PL启动子受阻遏，目的基因不表达；2）添加Trp（可添加蛋白胨）以后，trp启动子受阻遏，而PL启动子启动，此时可表达外源蛋白。A 培养基中不存在色氨酸B 培养基中不存在色氨酸cI蛋白合成（脱阻遏）无克隆基因蛋白合成（阻遏）克隆基因蛋白合成（脱阻遏）cI蛋白不合成（阻遏）（五）在其它微生物中的表达五）在其它微生物中的表达 除了E. coli以外，有些微生物也可以用作表达外源蛋白的宿主菌（受体菌）。 -半乳糖苷酶在不同受体菌中的表达： 苜蓿根瘤菌苜蓿根瘤菌豌豆根瘤菌豌豆根瘤菌恶臭假单胞菌恶臭假单胞菌大肠杆菌大肠杆菌 -半乳糖苷酶在不同受体菌中的表达分析： (1) 所有启动子在受体菌中都有一定的活性； (2) tac启动子在大肠杆菌中活性最高，但是在其它受体菌中活性最低； (3) 新霉素基因启动子（Nm）是在大肠杆菌中活性最低的启动子，但是在其它受体菌中驱动转录的活性却最高。 chloramphenicol acetyltransferase （氯霉素转乙酰基酶） -galactosidase （ -半乳糖苷酶） 其有效表达可在产碱杆菌（ Alcaligens sp.）, E. coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas stutzeri, 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）, 和粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）观察到. 在革兰氏阴性菌中通用的表达载体：pAV10 (1) 将转座子Tn5的一个末端倒置重复序列的70bp插入到一个广宿 主的、低拷贝数质粒pRK290的MCS中所得； (2) 其Tn5 DNA中含有2个独立的、但序列有部分重叠的启动子， 每个启动子分别调控一个Tn5基因的转录，因此该载体在许多 革兰氏阴性菌中都起作用。 该载体含有四环素抗性基因 (Tetr), 1个BglII 酶切位点，质粒复制子，启动子和1个多克隆位点（a multiple cloning sequence，MCS)。广广宿宿主主载载体体（六）非融合蛋白的表达 指所表达的外源蛋白的N-末端不含有其它任何氨基酸，因此要求其翻译起始位点ATG必须要位于其基因的5端。 表达非融合蛋白，一般要求其编码基因的ATG起始位点与核糖体结合位点（RBS）之间的距离要合适，否则即使仅相差23个bp，表达效率也会大受影响。 RBSATG最适距离的筛选： （1）在ATG上游约100 bp处寻找1个酶切位点，进行酶切； （2）再用核酸外切酶III（ExoIII）从该酶切位点开始，部分消化以上酶切片断，得到不同长度的消化片断； （3）将各消化片断与含有启动子序列和RBS序列的载体连接，构建成系列可表达的重组基因，导入受体菌进行表达量分析，从中筛选到最适的RBS-ATG距离。 （4）构建融合蛋白。 表达非融合蛋白的优势：表达非融合蛋白的优势： 单基因产物，不受其它蛋白质成分的干扰，有利于其展现完整功能和保持活性。 不利方面：不利方面：容易受到受体菌蛋白酶的降解，产量较低。 克服的方法：克服的方法： （1）用蛋白酶活性低的菌株作为受体菌。如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）蛋白酶活性强，而且具有外分泌性，但短芽孢杆菌（Bacillus brevis）的蛋白酶活性就低得多； （2）用黄嘌呤营养缺陷型菌株（Ion）作为受体菌。Ion为E. coli合成蛋白酶的主要底物。 （3）用蛋白酶抑制剂。如T4噬菌体的pin基因产物。可以将pin同时克隆到质粒载体上。（七）融合蛋白的表达及纯化（七）融合蛋白的表达及纯化 指所表达的外源蛋白与一种宿主蛋白共价连接，构成融合蛋白。 1、融合蛋白的表达、融合蛋白的表达1.“三夹板三夹板”式融式融合合2.3.C-C-末端融合末端融合N-N-末端融合末端融合运载蛋白运载蛋白运载蛋白运载蛋白异源功能蛋白异源功能蛋白运载蛋白运载蛋白运载蛋白运载蛋白异源功能蛋白异源功能蛋白异源功能蛋白异源功能蛋白通过在细胞膜跨膜蛋白中通过在细胞膜跨膜蛋白中“镶嵌镶嵌”外源蛋白，是一种典型的外源蛋白，是一种典型的“三夹板三夹板”式融合方式式融合方式 pPC系列载体：pPCZ1， pPCZ2和pPCZ3。彼此相差一个碱基。 1、 pPC载体组中每一个载 体 lacZ启动子、SD序列和lacZ 基因的前8个氨基酸编码序 列，在lacZ的下游有1个 EcoRI位点；2、 pPCZ1的EcoRI位点保 持不变，其末端为-G;3、pPCZ2的EcoRI位点之 前多了2个G，经EcoRI酶切 后的为-GGG；4、 pPCZ3的EcoRI位点之 前多了4个G，经EcoRI酶切 后的为-GGGGG。 2、融合蛋白的纯化、融合蛋白的纯化 将融合蛋白分割成宿主蛋白和外源蛋白的策略： （1）在融合蛋白和宿主蛋白之间加入一段可被蛋白酶识别的氨基酸序列，如Ile-Glu-Gly-Arg可被溶血因子X识别并在C端切开，并且这一段序列在自然状态下很少出现，因此可以用于分割融合蛋白； （2）在胰岛素中没有Met，因此在基因工程胰岛素和宿主蛋白之间可以加入一个Met，而表达的融合蛋白的Met在体外可以被CNBr转移性识别和切割，从而形成2条多肽链，1条是胰岛素，另1条是宿主多肽。经过进一步的提纯，就可以得到完整的胰岛素。 3、融合蛋白的应用、融合蛋白的应用 （1）在大多数情况下，融合蛋白本身就是很好的终产物，无需处理，如可以用融合蛋白来制备抗体； （2）由于融合蛋白的某些功能单元，可以用于简化提纯步骤。 现已开发大量的表达融合蛋白的商业性载体： 如Invitrogen公司： 细菌表达系统：pBADHis系列、pTrcHis系列等， 酵母菌表达系统：pPIC3.5K、pPIC9K等多种。（八）单一方向串连排列的基因八）单一方向串连排列的基因 在低拷贝质粒中表达多个串连排列的基因，以增加蛋白的表达量。 限制性内切酶AvaI的应用：表达多个串连基因的表达载体的构建 AvaI 单一方向串连排列基因构建方法： （1）先把含CTCGGG序列的质粒用AvaI切开，用DNA聚合酶I补平，两端与EcoRI接头连接，外源基因的起始和终止子都可以通过EcoRI位点克隆到载体上； （2）然后把这个重组片断再用AvaI切出，切出的DNA片断两端的粘性末端不同，因此连接时只能有一个方向； （3）由于插入外源基因使用的是单一的EcoRI位点，因此基因插入的方向有2个，其中只能有一个能够表达。（九）增强蛋白质的稳定性九）增强蛋白质的稳定性 构建和表达长半衰期的外源蛋白。 正常情况下蛋白质的半衰期：从几分钟到几小时不等。决定于： （1）二硫键二硫键形成情况。二硫键可以增强蛋白质的半衰期； （2）所表达的蛋白质的N端端是否有特定的氨基酸。一般可以通过在N端增加1个或几个氨基酸，来使蛋白质的半衰期延长。如：在-半乳糖苷酶的N端加上不同的氨基酸，体外存活的时间可以从2分钟到20小时不等。 （3）在可能的情况下，改变蛋白质中的“PEST”序列，但这种改变不能影响蛋白质的功能。 PEST序列序列：即存在于蛋白质分子内部的Pro（P）、Glu（E）、Ser（S）和Thr（T），由于在它们的两端往往存在 带正电的氨基酸残基，极易受到蛋白酶的攻击。 （十）将外源基因整合入染色体上十）将外源基因整合入染色体上 （1）相对稳定地存在，没有选择压力时也可长期保存； （2）外源基因的整合位点不能位于对宿主菌特别重要的基因内部； （3）一般整合到染色体上的目的基因最好也是由可调控的启动子进行调控。 外源基因的整合途径：（1）转座作用转座作用（包括插入序列）； （2）同源交换同源交换。 A、双交换的发生：双交换的发生：仅目的基因整合到染色体上仅目的基因整合到染色体上B、单交换：单交换：整个质粒整合到染色体上整个质粒整合到染色体上使用使用Marker可以很方便可以很方便地筛选整合重组菌株地筛选整合重组菌株 -淀粉酶基因整合到染色体上的拷贝数与未发生整合但由多淀粉酶基因整合到染色体上的拷贝数与未发生整合但由多拷贝质粒携带时表达活性的比较拷贝质粒携带时表达活性的比较（十一）外源蛋白的分泌十一）外源蛋白的分泌 分泌途径： （1）分泌到周质区（周质空间）； （2）完全分泌到细胞外的培养基中。 大肠杆菌蛋白的途径：（1）N端有分泌信号的蛋白：端有分泌信号的蛋白： 信号肽以及一组以Sec命名的蛋白：SecA、B、D、E、F和Y等， 一般仅分泌到周质空间。 （2） C端有分泌信号的蛋白：端有分泌信号的蛋白： -溶血素（-hemolysin）: 可完全分泌到培养基中。 （一）包含体蛋白的提取一）包含体蛋白的提取 包含体蛋白：Inclusion body 在大肠杆菌中当外源蛋白的表达量达到20时，由于表达部位的低电势和外源蛋白分子的特殊结构（如富含Cys、无糖基化等），使外源蛋白与其周围的其它杂蛋白及其核酸一起形成的一种不溶性的结构。 在大肠杆菌中所表达的外援蛋白大部分都是以包含体的形式存在。第二节第二节 原核生物表达产物的分离纯化原核生物表达产物的分离纯化 包含体蛋白的提取步骤：包含体蛋白的提取步骤： （1）菌体的收获、破碎与包含体的洗涤）菌体的收获、破碎与包含体的洗涤 一般可在500010000g下离心收集菌体，然后进行菌体的破碎。 菌体常用破碎方法： 物理方法：Sonication/French Pressure 化学方法：Lysozyme（溶菌酶）、表面活性剂、 强碱（须考虑外源蛋白的耐受性） 洗涤目的：去除吸附在包含体表面的不溶性杂蛋白。常用洗涤液： 1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、NP40等； 可以在中性去垢剂中再添加EDTA和二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇等还原剂，并保持NaCl的浓度为50 mM； 低浓度盐酸胍或中性去垢剂、EDTA及还原剂共同使用。加入的洗涤液可以通过柱层析等方法除去。 包含体蛋白的提取步骤：包含体蛋白的提取步骤： （1）菌体的收获、破碎与包含体的洗涤）菌体的收获、破碎与包含体的洗涤 一般可在500010000g下离心收集菌体，然后进行菌体的破碎。 菌体常用破碎方法： 物理方法：Sonication/French Pressure 化学方法：Lysozyme（溶菌酶）、表面活性剂、 强碱（须考虑外源蛋白的耐受性） 洗涤目的：去除吸附在包含体表面的不溶性杂蛋白。常用洗涤液： 1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、NP40等； 可以在中性去垢剂中再添加EDTA和二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇等还原剂，并保持NaCl的浓度为50 mM； 低浓度盐酸胍或中性去垢剂、EDTA及还原剂共同使用。加入的洗涤液可以通过柱层析等方法除去。 （2）包含体的融解）包含体的融解 包含体是通过疏水作用力、氢键、离子键和二硫键等维持的，融解时必须综合考虑变性剂的浓度、温度、作用时间、溶液离子强度、pH值及其蛋白质浓度与变性剂的比值等多种复杂因素。 SDS：是曾经广泛使用的溶解剂，可以在低浓度（1）下使包含体溶解。但是结合到外源蛋白上的SDS分子很难除去，这种蛋白作为药物使用的话，可能会造成流产；同时少量氧化物的存在会造成外源蛋白的共价修饰，因此目前很多国家的政府机构，已经禁止用SDS溶解的蛋白产品上市。 尿素和盐酸胍：对包含体的氢键有较强的可逆变性作用。一般人们采用810 mol/L的尿素溶解包含体，其溶解速度较慢，溶解度为7090。在复性后不会造成蛋白质的严重损失，同时还可以选用多种层析方法对提取到的包含体进行纯化。目前，尿素已被广泛用于包含体的溶解。 盐酸胍的溶解效率很高，可以达到95以上，且溶解速度快，因而不会对外源蛋白进行共价修饰。但是，它的缺点就是成本较高，而且除去盐酸胍会造成较大的蛋白质损失，另外，盐酸胍对于外源蛋白进行进一步的离子交换层析有干扰作用。 一般变性时要考虑以下几方面的因素： 变性剂的浓度及变化率； 外源蛋白的浓度及其纯度； 氧化还原剂的选择； pH值的选择； 适当的离子强度； 合适的温度和作用时间； 分子伴侣的作用（chaperone）（二）表达蛋白纯化的基本原则（二）表达蛋白纯化的基本原则 1、针对不同的产物表达形式采取不同的策略；、针对不同的产物表达形式采取不同的策略； （1）对于体积大、浓度低的分泌蛋白体系，先通常先要进行浓缩处理， 如沉淀、超滤； （2）可溶性表达产物先用亲和层析法进行纯化； （3）对于在壁膜间隙中表达的蛋白介于分泌性蛋白和细胞内可溶性蛋白两者之间，可以先用低浓度溶菌酶处理，再用渗透压休克法进行纯化； 2、针对不同性质的蛋白质选用不同的层析类型、针对不同性质的蛋白质选用不同的层析类型 （1）用离子交换层析分离具有不同等电点的蛋白质。用离子交换层析分离具有不同等电点的蛋白质。通常选择各蛋白质的滴定曲线没有交叉的pH值作为缓冲液的pH值，同时还应考虑该蛋白质在该pH值下的稳定性和溶解性； （2）用离子交换层析分离等电点相同但表面电荷分布不同的用离子交换层析分离等电点相同但表面电荷分布不同的蛋白质。蛋白质。一般等电点处于极端位置（pI8）的基因工程蛋白质应首选离子交换层析方法； （3）不同蛋白质可以选用不同的特异性亲和配基。不同蛋白质可以选用不同的特异性亲和配基。如酶和底物、抗原和抗体、糖链和凝集素等； （4）对于具有明显亲水和疏水性的蛋白质，可以选用疏水作选用疏水作用层析和反相作用层析用层析和反相作用层析；（5）凝胶排阻层析对于除去包含体中的杂蛋白很有效凝胶排阻层析对于除去包含体中的杂蛋白很有效：在E. coli等中表达的外源蛋白相对分子量均在1.5104左右，而且大多数以包含体的形式存在，而包含体中的杂质蛋白的相对分子量通常大于3.0104。 2、针对不同性质的蛋白质选用不同的层析类型、针对不同性质的蛋白质选用不同的层析类型 （1）用离子交换层析分离具有不同等电点的蛋白质。用离子交换层析分离具有不同等电点的蛋白质。通常选择各蛋白质的滴定曲线没有交叉的pH值作为缓冲液的pH值，同时还应考虑该蛋白质在该pH值下的稳定性和溶解性； （2）用离子交换层析分离等电点相同但表面电荷分布不同的用离子交换层析分离等电点相同但表面电荷分布不同的蛋白质。蛋白质。一般等电点处于极端位置（pI8）的基因工程蛋白质应首选离子交换层析方法； （3）不同蛋白质可以选用不同的特异性亲和配基。不同蛋白质可以选用不同的特异性亲和配基。如酶和底物、抗原和抗体、糖链和凝集素等； （4）对于具有明显亲水和疏水性的蛋白质，可以选用疏水作选用疏水作用层析和反相作用层析用层析和反相作用层析；（5）凝胶排阻层析对于除去包含体中的杂蛋白很有效凝胶排阻层析对于除去包含体中的杂蛋白很有效：在E. coli等中表达的外源蛋白相对分子量均在1.5104左右，而且大多数以包含体的形式存在，而包含体中的杂质蛋白的相对分子量通常大于3.0104。 3、多种分离纯化技术的综合运用、多种分离纯化技术的综合运用 （1）应选择不同分离纯化机理的方法共同使用； （2）应首先设法除去含量最多的杂质； （3）要尽量采用高效分离方法； （4）要把最费时、成本最高的分离方法安排在最后的阶段 4、选择合适的分离纯化材料、选择合适的分离纯化材料 要求：（1）有较高的分离效率； （2）在分离纯化过程中不会造成目的蛋白的变性； （3）化学和机械性能稳定，重复性好； （4）成本较低 5、分离纯化过程的规模化、分离纯化过程的规模化 规模化可以降低成本。（三）表达蛋白的（三）表达蛋白的PEG化化 对表达的蛋白质进行聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）修饰，以达到降低免疫原性，延长半衰期，保持药效活性的目的。 PEG化的途径： （1）用氰脲酰氯、N羟基丁二酰等活化的PEG可以与氨基发生反应； （2）用马来酸酐和-氨基乙酸活化的PEG可以与巯基进行反应； （3）PEG可以与蛋白质的羧基发生反应。 用氰尿酰氯活化的用氰尿酰氯活化的PEG对蛋白质的修饰作用对蛋白质的修饰作用