1.2 基因工程的基本基因工程的基本操作程序操作程序1）目的基因的获取）目的基因的获取2）基因表达载体基因表达载体的构建的构建3）将目的基因导入受体细胞）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测与鉴定）目的基因的检测与鉴定基因工程的四个基本步骤：基因工程的四个基本步骤：一、目的基因的获取一、目的基因的获取从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因人工合成人工合成 目的基因是目的基因是编码蛋白质编码蛋白质的基因。的基因。1.1.从基因文库中获取目的基因：从基因文库中获取目的基因：基因文库基因文库: : 基因组文库基因组文库: : 部分基因文库部分基因文库: :将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片段片段,导入导入受体菌的群体中储存受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。生物的不同的基因。基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中包含了一种生物所有的基因.基因文库中包含了一种生物的一部分基因。如基因文库中包含了一种生物的一部分基因。如cDNA文库。文库。2.利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3.3.人工合成基因法人工合成基因法基因比较小，核苷酸序列已知。基因比较小，核苷酸序列已知。二、二、基因表达载体基因表达载体的构建（的构建（核心核心）1.目的：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能表达。传给下一代，同时，使目的基因能表达。2.组成：组成：目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因3.3.构建方法构建方法（1 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。切口，露出黏性末端。（2 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。相同的黏性末端。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量再加入适量DNADNA连接酶，形成了一个重组连接酶，形成了一个重组DNADNA分分子（重组质粒）子（重组质粒）二、二、基因表达载体的构建（基因表达载体的构建（核心核心）启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因基因的首基因的首端端，RNA聚聚合合酶酶识别、结合部位识别、结合部位，驱动基因的转录。驱动基因的转录。基因的尾端，使转录基因的尾端，使转录停止。停止。鉴别受体细胞是否含目鉴别受体细胞是否含目的基因（如抗生素抗性的基因（如抗生素抗性基因）基因）三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。内维持稳定和表达的过程。1.转化转化2.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）常用方法：）常用方法：农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌转化法过程农杆菌转化法过程适用：适用： 双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物受体细胞：受体细胞：植物活细胞植物活细胞植物植物组织组织培养培养技术技术（2）其他方法）其他方法基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法（适用于单子叶植物）（适用于单子叶植物）3.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术(2)转基因动物受体细胞转基因动物受体细胞受精卵或早期胚胎细胞受精卵或早期胚胎细胞(1)方法：方法：4.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞(2)原核生物作为受体细胞的优点原核生物作为受体细胞的优点繁殖快、多为单细胞，遗传物质相对较少。繁殖快、多为单细胞，遗传物质相对较少。(1)过程过程细胞经细胞经Ca2+处理成处理成感受态细胞感受态细胞，和重组表达载，和重组表达载体混合，完成转化。体混合，完成转化。四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定(1)转基因生物的染色体转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的上是否插入了目的基因基因1.分子水平检测分子水平检测方法：方法： DNA分子杂交技术，是否出现杂交带。分子杂交技术，是否出现杂交带。四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1.分子水平检测分子水平检测(2)目的基因是否转录出目的基因是否转录出mRNA(3)目的基因是否翻译成蛋白质目的基因是否翻译成蛋白质分子杂交技术，是否出现杂交带分子杂交技术，是否出现杂交带抗原抗体杂交，是否出现杂交带抗原抗体杂交，是否出现杂交带2.个体水平的鉴定个体水平的鉴定如抗虫或抗病的如抗虫或抗病的接种接种实验、基因工程产品与天实验、基因工程产品与天然产品的然产品的功能活性功能活性比较比较知识小结：知识小结：