课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离专题专题5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。一、基础知识：一、基础知识： 凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有网状结构的凝，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。胶的分子筛作用，来进行分离。3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（ ）的蛋白质容易进）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（入凝胶内部的通道，路程（ ），移动），移动速度（速度（ ），而（），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（）移动，路程（ ），移动），移动速度（速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。因此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快4、具体过程、具体过程凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 1、概念：在一定的范围内，能对抗外、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：缓冲溶液： 2、作用：、作用： 能够抵制（能够抵制（ ）的对溶）的对溶液的（液的（ ）的影响，维持）的影响，维持PH基本基本不变。不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（）就可以制得（ ）使）使用的缓冲液。用的缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内人体血液中缓冲液人体血液中缓冲液: NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3电泳：电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。生迁移的过程。 2、原理：许多重要的生物大分子，如（、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有）等都具有( ) 在在( )下下，这些基团会带上（，这些基团会带上（ ） 。在。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（）以及分子本身（ ）、（）、（ ）的）的不同使带电分子产生不同使带电分子产生不同的（不同的（ ），从而实现样品中），从而实现样品中各种分子的分离。各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH分类：分类：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和和聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定（测定（ ）通常用十二烷基硫酸钠（通常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙聚丙稀酰胺凝胶电泳稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用的作用下会解聚成单条肽链，下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合复合物，物，SDS所所带带负电荷负电荷的量大大超过了蛋白质分的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸带负电荷核酸带负电荷，在电场中向正极移动。，在电场中向正极移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以对其鉴条带的粗细和分布的位置，可以对其鉴定。定。 说明：说明：电泳检测结果电泳检测结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳（四）血红蛋白（四）血红蛋白在在红细胞的胞的组成中，成中，约90%是血是血红蛋白。蛋白。它由它由四个四个肽链组成，成，包括两个包括两个肽链和和两个两个肽链。每条。每条肽链环绕一个一个亚铁血血红素素基基团，可携，可携带一分子氧或一分一分子氧或一分子二氧化碳子二氧化碳。血。血红蛋白因含蛋白因含血血红素而素而呈呈现红色。色。二、实验操作二、实验操作蛋白蛋白质的提取和分离一般分的提取和分离一般分为四步：四步：（1）样品品处理：包括洗理：包括洗涤红细胞；血胞；血红蛋白稀蛋白稀释；离心等操作收集到的血；离心等操作收集到的血红蛋白蛋白溶液。溶液。（2）粗分离：透析除去分子）粗分离：透析除去分子较小的小的杂质。（3）纯化：通化：通过凝胶色凝胶色谱法将分子量法将分子量较大的大的杂质蛋白蛋白质除去。除去。（4）纯度度鉴定：通定：通过聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳鉴定。定。二二 实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（ ）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链90（一）样品处理（一）样品处理1、红细胞的洗胞的洗涤：目的是去除目的是去除杂蛋白。要加入蛋白。要加入柠檬酸檬酸钠防止血液凝防止血液凝固；离心将血液分固；离心将血液分层，用胶，用胶头吸管吸出黄色血吸管吸出黄色血浆；用生理用生理盐水洗水洗涤。2、血、血红蛋白的蛋白的释放：放：在蒸在蒸馏水和甲苯作用下，水和甲苯作用下，红细胞破裂胞破裂释放放3、分离血、分离血红蛋白溶液：蛋白溶液：离心分离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀去除脂溶性沉淀层；分液漏；分液漏斗分出斗分出红色透明液体。色透明液体。4、透析：、透析：装入透析袋并置于磷酸装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（冲液中（PH为7.0）透）透析。析。红细胞的洗涤红细胞的洗涤分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物暗红色沉淀物练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数分子数和和CO2分子数分别是分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序分层顺序自上而下自上而下是：是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀考试宝典考试宝典 www.yixuemao.com www.yixuemao.com 考试宝典考试宝典 wpe36xrz wpe36xrz 是在这里蹲点吧！是在这里蹲点吧！”“”“你就不能配合点吗。你就不能配合点吗。”“”“你又没让我配合。你又没让我配合。”被人遗忘的慕容凌娢终于从地上站了起来，但被人遗忘的慕容凌娢终于从地上站了起来，但感觉自己的脑细胞正急速死亡，智商再次跌入谷底。韩哲轩怎么会知道我的真名？百蝶好像也知道他去找过夏桦。感觉自己的脑细胞正急速死亡，智商再次跌入谷底。韩哲轩怎么会知道我的真名？百蝶好像也知道他去找过夏桦。“呃呃”慕容凌娢强壮镇定的笑了笑，慕容凌娢强壮镇定的笑了笑，“韩哲轩你怎么会在这里？韩哲轩你怎么会在这里？”“”“百蝶不是说了吗，我就是在这里专门等你们的。百蝶不是说了吗，我就是在这里专门等你们的。”韩哲轩极其爽快的承认了自己的行为，韩哲轩极其爽快的承认了自己的行为，“我看见你们两个出来，就跟上了。刚想叫住你就看见你往后摔了我看见你们两个出来，就跟上了。刚想叫住你就看见你往后摔了幸好我闪幸好我闪的快的快”这剧情跟我想的怎么不一样？按照言情小说的正常套路，我不是应该被人准确无误的接住吗？然后不就顺理这剧情跟我想的怎么不一样？按照言情小说的正常套路，我不是应该被人准确无误的接住吗？然后不就顺理成章的成章的慕容凌娢居然做起了花痴的白日梦。慕容凌娢把自己的幻想和现实仔细对照了一下，又看了看面前这个笑得慕容凌娢居然做起了花痴的白日梦。慕容凌娢把自己的幻想和现实仔细对照了一下，又看了看面前这个笑得漫不经心的人，悲痛的捂住了脸漫不经心的人，悲痛的捂住了脸童话里的故事果真都是骗人的童话里的故事果真都是骗人的自己怎么能指望这种人呢？自己怎么能指望这种人呢？“凌娢你怎么了？凌娢你怎么了？”百蝶看着一直发呆的慕容凌娢，稍许有些担忧，百蝶看着一直发呆的慕容凌娢，稍许有些担忧，“不会真的摔傻了吧！不会真的摔傻了吧！”“”“没没没事。没事。”慕容凌娢紧张的摇了摇头，慕容凌娢紧张的摇了摇头，生怕百蝶看出什么端倪。生怕百蝶看出什么端倪。“不过韩哲轩，你怎么会知道我的真名？不过韩哲轩，你怎么会知道我的真名？”既然韩哲轩知道了自己的名字，也就是知道了自己既然韩哲轩知道了自己的名字，也就是知道了自己一开始就说了谎，真的好尴尬啊！一开始就说了谎，真的好尴尬啊！“像我这种开挂玩家，怎么能连这种东西都不知道呢。像我这种开挂玩家，怎么能连这种东西都不知道呢。”韩哲轩居然没有再提起韩哲轩居然没有再提起“白白绫绫”这个化名，这让慕容凌娢很是欣慰。这个化名，这让慕容凌娢很是欣慰。“是夏先生告诉你的吧！是夏先生告诉你的吧！”慕容凌娢绝对不会相信这是可以猜到的东西。慕容凌娢绝对不会相信这是可以猜到的东西。“如如果你乐意这样想，我不介意。果你乐意这样想，我不介意。”( (古风一言古风一言) )那时，谁绣芙蓉鸳鸯戏。而今，谁惹青丝千里外。第那时，谁绣芙蓉鸳鸯戏。而今，谁惹青丝千里外。第016016章章 原来不是青楼原来不是青楼“是夏先生告诉你的吧！我的真名。是夏先生告诉你的吧！我的真名。”慕容凌娢绝对不会相信这是可以猜到的东西。慕容凌娢绝对不会相信这是可以猜到的东西。“如果你乐意这样想，我不介意。如果你乐意这样想，我不介意。”韩哲轩摊开双手，还是一副漫不经心的样子。韩哲轩摊开双手，还是一副漫不经心的样子。“那看来是我想错了，你是怎么知道的？那看来是我想错了，你是怎么知道的？”“”“猜得。猜得。”“”“哦，原来是这样哦，原来是这样啊啊”慕容凌娢表面上笑着说，心里却在告诫自己，冷静慕容凌娢表面上笑着说，心里却在告诫自己，冷静一定要冷静，不能着急，不能生气一定要冷静，不能着急，不能生气这算是答复吗？这算是答复吗？太敷衍了吧！不想告诉我就直说吗，真是烦人。韩哲轩最终也没有告诉慕容凌娢他是怎么知道她的真实姓名的，因为这太敷衍了吧！不想告诉我就直说吗，真是烦人。韩哲轩最终也没有告诉慕容凌娢他是怎么知道她的真实姓名的，因为这个话题很快就被百蝶机智的转移了，她可不想看着两个人如此尴尬的僵持在大街上，毕竟这样太引人注意了。个话题很快就被百蝶机智的转移了，她可不想看着两个人如此尴尬的僵持在大街上，毕竟这样太引人注意了。“凌娢，凌娢，你不是觉得饿了吗？赶快走吧。你不是觉得饿了吗？赶快走吧。”百蝶拉着慕容凌娢的胳膊便将她向前拖去，强行拉开了她和韩哲轩的距离。百蝶拉着慕容凌娢的胳膊便将她向前拖去，强行拉开了她和韩哲轩的距离。“就是，就是，如果为了那种小事而饿死在大街上可就划不来了。如果为了那种小事而饿死在大街上可就划不来了。”要不是被百蝶拉着，慕容凌娢早就扑上去把韩哲轩暴打一顿了，尤要不是被百蝶拉着，慕容凌娢早就扑上去把韩哲轩暴打一顿了，尤其是他那张好看但欠揍的脸，总是笑得让人很不爽。不过话说回来，那个高度对她来说可能不太好触碰。其是他那张好看但欠揍的脸，总是笑得让人很不爽。不过话说回来，那个高度对她来说可能不太好触碰。“要不是害怕要不是害怕胳膊疼，我早就把你的脸打成猪头了！胳膊疼，我早就把你的脸打成猪头了！”就算打不成，气势就算打不成，气势