免疫组化技术免疫组化技术常见问题及处理方法常见问题及处理方法1免疫组织化学的定义免疫组织化学的定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 2免疫组织化学的原理免疫组织化学的原理根据抗原抗体反应和化学显色原理根据抗原抗体反应和化学显色原理组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合利用一抗与标记生物素（利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光、荧光素等的二抗进行反应素等的二抗进行反应通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成分的分布和含量分的分布和含量34免疫组织化学的分类免疫组织化学的分类按标记物质的种类，可分为按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、酶标记、胶体金标记、荧光标记和放射性标记等荧光标记和放射性标记等按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多接法的灵敏度提高了许多5按结合方式可分为抗原按结合方式可分为抗原- 抗体结合，如过氧化物抗体结合，如过氧化物酶酶- 抗过氧化物酶（抗过氧化物酶（PAP ）法；亲和连接，如卵）法；亲和连接，如卵白素白素- 生物素生物素-过氧化物酶复合物（过氧化物酶复合物（ABC ）法、链）法、链霉菌抗生物素蛋白霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（过氧化物酶连结（SP）法等）法等SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测的组织抗原检测6可被检测的物质可被检测的物质组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测行检测7免疫组织化学的特点免疫组织化学的特点 1）特异性强）特异性强2）敏感性高）敏感性高3）定位准确、形态与功能相结合）定位准确、形态与功能相结合8Western blotting、ELISA与免疫组化的异同与免疫组化的异同Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织：蛋白质免疫印迹，检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位，技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位，但敏感性远远低于免疫组化技术但敏感性远远低于免疫组化技术ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一9免疫组织化学方法的基本步骤免疫组织化学方法的基本步骤组织和细胞的处理组织和细胞的处理抗原修复抗原修复染色染色 10鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清）鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清）鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体特异性较高特异性较高背景较干净背景较干净有多种潜在用途有多种潜在用途但敏感性、亲和力低但敏感性、亲和力低兔多克隆抗体（兔抗血清）兔多克隆抗体（兔抗血清）高敏感性、亲和力高敏感性、亲和力可能有较多的交叉反应可能有较多的交叉反应更多的潜在用途更多的潜在用途11SPSP法法1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。 2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3. 每张切片加1滴或50l过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50l正常非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50l的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分钟。126. 除去PBS液，每张切片加1滴或50l生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。 7. 除去PBS液，每张切片加1滴或50l链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。 8. 除去PBS液，每张切片加2滴或100l新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-10分钟。 9. 自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。 10.如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。13二步法二步法(Envision(Envision系统系统) )1）脱蜡、水化组织切片。 2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。 3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS 或TBS 冲洗。 4）滴加一抗，室温或 37孵育30-60分钟，或 4过夜，PBS或TBS浸洗3分钟5次。 5）滴加enhangcer 增强剂（试剂A），37度30min ，PBS或TBS浸洗3 分钟5次。 6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体（试剂B），室温37孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟5次。 7）应用DAB 溶液显色。 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。14EnvisionEnvision系统的优点系统的优点 敏感性高敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰）背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单步骤简单15石蜡切片标本的固定石蜡切片标本的固定1 1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好、组织离体后尽快固定，切开固定效果好2 2、固定液以、固定液以1010中性福尔马林缓冲液为佳中性福尔马林缓冲液为佳3 3、固固定定时时间间在在4h-24h4h-24h之之间间，长长时时间间固固定定会会影影响响抗抗原决定簇的暴露，产生阴性结果原决定簇的暴露，产生阴性结果4 4、固定液的量要超过组织体积、固定液的量要超过组织体积5 5倍以上倍以上 如如果果组组织织固固定定不不及及时时或或不不完完全全固固定定,HE,HE染染色色细细胞胞核核发发灰灰模模糊糊，对对比比不不鲜鲜明明；免免疫疫组组化化染染色色结结果果不不理想，通常组织离体理想，通常组织离体2h2h后抗原完全丢失后抗原完全丢失16固定不充分固定不充分1718192021222324标本的取材、脱水、浸蜡标本的取材、脱水、浸蜡标本的取材厚度以标本的取材厚度以2mm2mm为宜为宜梯度酒精脱水尽量彻底充分梯度酒精脱水尽量彻底充分二甲苯透明时间不宜长，二甲苯透明时间不宜长，1 13h3h为佳，透明过度会导致组为佳，透明过度会导致组织发硬发脆织发硬发脆浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分 如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷，如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷，而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片25标本的切片、捞片、烤片标本的切片、捞片、烤片切片通常以切片通常以3 34um4um的厚度为宜的厚度为宜, ,太厚易掉片，细胞太厚易掉片，细胞重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（48485050）8080烘烤烘烤1 12h2h玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性26冰冻切片的处理冰冻切片的处理冰冻切片的组织抗原保存好冰冻切片的组织抗原保存好通常以通常以5um5um的厚度为佳的厚度为佳冷风吹干后用纯丙酮固定冷风吹干后用纯丙酮固定2 2遍遍, ,干燥置入干燥置入4 4 冰箱冰箱短期保存，短期保存，2020冰箱长期干燥保存冰箱长期干燥保存缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细胞肿胀等现象胞肿胀等现象27细胞涂片的处理细胞涂片的处理培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固定定2 2遍，遍，4 4 或或20 20 冰箱保存冰箱保存28抗原修复抗原修复概念概念: :应用物理或化学的方法将组织固定过程中应用物理或化学的方法将组织固定过程中封闭的抗原决定簇修复暴露的过程称为抗原修复封闭的抗原决定簇修复暴露的过程称为抗原修复原因：原因：甲醛固定过程中形成醛键和羧甲基而封闭甲醛固定过程中形成醛键和羧甲基而封闭部分抗原决定簇，固定时，蛋白与蛋白之间发生部分抗原决定簇，固定时，蛋白与蛋白之间发生交联交联, ,可能会封闭抗原决定簇可能会封闭抗原决定簇29抗原修复的方法抗原修复的方法酶消化：酶消化： 如胰蛋白酶、蛋白水解酶如胰蛋白酶、蛋白水解酶热抗原修复（热抗原修复（HIERHIER）：水浴；微波炉；高压锅；高压消毒锅水浴；微波炉；高压锅；高压消毒锅；蒸汽室蒸汽室超声波超声波以上综合运用以上综合运用修复方法从强到弱为：高压修复、微波修复、胰酶修修复方法从强到弱为：高压修复、微波修复、胰酶修复复30热抗原修复热抗原修复更有效：染色结果更一致，操作更单一更有效：染色结果更一致，操作更单一事先确定的热修复时间可适用于几乎所有的组织事先确定的热修复时间可适用于几乎所有的组织 一抗可以进一步稀释（节省费用）一抗可以进一步稀释（节省费用）有些抗体只有采用热抗原修复才有效有些抗体只有采用热抗原修复才有效31高压锅热抗原修复高压锅热抗原修复比微波更有效比微波更有效能处理大批量的切片能处理大批量的切片达到更高的温度达到更高的温度 加热均匀（不像微波炉有热点和冷点）和节省时间加热均匀（不像微波炉有热点和冷点）和节省时间32高压锅热抗原修复高压锅热抗原修复将高压锅中的缓冲液煮开（不加盖）将高压锅中的缓冲液煮开（不加盖）将切片放入沸腾的缓冲液将切片放入沸腾的缓冲液盖紧盖子和高压阀，加热至全压力盖紧盖子和高压阀，加热至全压力达到全压力后才能计时，最佳时间由各个实验室自达到全压力后才能计时，最佳时间由各个实验室自行确定行确定-通常在通常在2-42-4分钟分钟 33热抗原修复：注意事项热抗原修复：注意事项无论哪一步都不要让切片干涸（抗原可完全丢失）无论哪一步都不要让切片干涸（抗原可完全丢失）加热后需要冷却加热后需要冷却15153030分钟（个别未折叠的蛋白链分钟（个别未折叠的蛋白链恢复到原来的构型）恢复到原来的构型）34热抗原修复存在的问题热抗原修复存在的问题过度的热修复会导致组织形态的破坏或组织完全消过度的热修复会导致组织形态的破坏或组织完全消化，免疫染色变弱或定位不准确化，免疫染色变弱或定位不准确有一个时间点，超过这个时间点进一步热修复也不有一个时间点，超过这个时间点进一步热修复也不会获得更强的染色效果会获得更强的染色效果解决方法解决方法：采用较短时间热修复或酶消化重复实验采用较短时间热修复或酶消化重复实验35修复过度的实验组修复过度的实验组36修复过度的实验组修复过度的实验组37修复过度的对照组修复过度的对照组38修复过度的对照组修复过度的对照组39酶消化修复酶消化修复40缩短修复时间缩短修复时间41 热修复抗原会导致内源性生物素反应增强，应用热修复抗原会导致内源性生物素反应增强，应用卵白素抗生物素系统会产生假阳性卵白素抗生物素系统会产生假阳性富含内源性生物素的组织：富含内源性生物素的组织： 肝细胞肝细胞 线抗体丰富的组织如肾脏、甲状腺、嗜酸细胞等线抗体丰富的组织如肾脏、甲状腺、嗜酸细胞等 胞浆丰富的肿瘤细胞胞浆丰富的肿瘤细胞热抗原修复的问题：内源性生物素热抗原修复的问题：内源性生物素42 组织在热修复之后，用组织在热修复之后，用3 3的新鲜的新鲜H H2 2O O2 2进行封闭，进行封闭， 以以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min10min，再，再用用1010鸡（鸭）蛋清阻断鸡（鸭）蛋清阻断10101515分钟，清洗后滴加一分钟，清洗后滴加一抗抗 应用非生物素系统的检测试剂盒，如应用非生物素系统的检测试剂盒，如EnVisionEnVision系统系统阻断内源性生物素的方法阻断内源性生物素的方法43热抗原修复的缓冲液热抗原修复的缓冲液pH6.0 pH6.0 柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液（最常用）、尿素、（最常用）、尿素、Tris-HClTris-HCl、商品商品化修复液等化修复液等碱性碱性 pH pH 修复液常对绝大多数抗体的效果更好修复液常对绝大多数抗体的效果更好推荐使用：推荐使用：EDTAEDTA缓冲液缓冲液 pH 8.0pH 8.0或或Tris-EDTATris-EDTA缓冲液缓冲液pH 9.0 pH 9.0 是较好的常规修复液是较好的常规修复液，可用于大多数热修复有效的抗体可用于大多数热修复有效的抗体44抗体孵育条件抗体孵育条件主要抗体浓度、温度、时间，三者一般是相互成主要抗体浓度、温度、时间，三者一般是相互成反比的（相对）反比的（相对）浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度，浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度，时间决定反应的量时间决定反应的量温度有温度有 4 度、室温、度、室温、37度，其中度，其中4 度最佳，反应度最佳，反应最温和，背景较浅；而最温和，背景较浅；而 37度反应速度较快，时间度反应速度较快，时间较短；室温不太提倡较短；室温不太提倡4度过夜和从冰箱拿出后需度过夜和从冰箱拿出后需37度复温度复温45min45复温的必要性复温的必要性防止切片从防止切片从4度直接放入度直接放入PBS易脱片易脱片使抗原抗体结合更稳定使抗原抗体结合更稳定 4度和度和37度时分子运动方式不同度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机前者分子碰撞机率和运动速度小于后者率和运动速度小于后者,后者结合更快后者结合更快,但敏感性但敏感性也提高了并易造成非特异染色也提高了并易造成非特异染色46脱片产生的原因和如何防止脱片脱片产生的原因和如何防止脱片多聚赖氨酸玻片的质量问题多聚赖氨酸玻片的质量问题切片问题：切片较厚或者不均匀切片问题：切片较厚或者不均匀组织本身的问题：癌症组织中坏死组织越多越容组织本身的问题：癌症组织中坏死组织越多越容易脱片易脱片烤片的时间短、温度不够烤片的时间短、温度不够操作的时候甩的过猛，有脱片嫌疑的片子最好不操作的时候甩的过猛，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用吸水纸从边缘上慢慢吸水甩或轻轻甩，用吸水纸从边缘上慢慢吸水修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长，玻修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长，玻片架放进沸腾的修复液时需轻柔片架放进沸腾的修复液时需轻柔47背景染色较深的原因背景染色较深的原因（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度适合自己实验室的理想工作浓度（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，避免因遗忘而造成时间是，严格执行操作规程，避免因遗忘而造成时间延长。时间和温度要根据染色结果进行调整延长。时间和温度要根据染色结果进行调整 48（3）DAB变质和显色时间太长：变质和显色时间太长：DAB最好现用最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，不应存放时间太长，DAB的显色最好在显微的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应（4）组织变干）组织变干（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于（大于24小时）小时）（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体）一抗变质、质量差的多克隆抗体49DAB染色后切片着色呈阴性结果染色后切片着色呈阴性结果抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误抗原修复不全或者不充分抗原修复不全或者不充分组织切片本身这种抗原含量低组织切片本身这种抗原含量低 血清封闭时间过长血清封闭时间过长DAB孵育时间过短孵育时间过短细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应50DAB显色时间的把握显色时间的把握（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗（2）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，说明抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下褐色，说明抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间；或前面的封闭非特异调抗体浓度或缩短抗体孵育时间；或前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间性蛋白不全，需要延长封闭时间 （3）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，说明抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗说明抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）度过夜）；或封闭时间过长；或封闭时间过长51免疫组化对照和质量控制免疫组化对照和质量控制阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照免疫组化的标准化免疫组化的标准化外部质量控制体系外部质量控制体系525354555657脱水、透明、封片、拍照脱水、透明、封片、拍照脱水、透明要彻底脱水、透明要彻底封片时尽量避免留有气泡封片时尽量避免留有气泡拍照尽量在两周内拍照尽量在两周内拍照尽量选择干净、清晰的视野，无杂质无破碎拍照尽量选择干净、清晰的视野，无杂质无破碎组织组织所拍照片尽量在同一种状态下，使背景保持一致所拍照片尽量在同一种状态下，使背景保持一致照片标识清楚照片标识清楚58免疫组化染色的评分免疫组化染色的评分强度：强度： 0 0分分 无色无色 1 1分分 淡黄色淡黄色 2 2分分 棕黄色棕黄色 3 3分分 棕褐色棕褐色细胞数细胞数: 0分分 无无 1分分 10 2分分 1150 3分分 5175 4分分 75 两者乘积两者乘积3分为阳性。分为阳性。乘积法：乘积法：59免疫组化染色的评分免疫组化染色的评分阳性细胞数的百分比：阳性细胞数的百分比： (+) (+) 阳性细胞数阳性细胞数25%25%,25%,50%,50%,75%75%60