临床常用免疫学检查临床常用免疫学检查 中山大学附属第三医院中山大学附属第三医院 风湿内科风湿内科 潘云峰潘云峰 2006-12 2006-12本章节重点l临床参考值l临床意义l选用原则临床常用免疫学检查l免疫l免疫学l免疫学检测：1.特异性免疫功能检查 2.非特异性免疫功能检查免疫学检测l特异性免疫功能检查：检测相应的抗原、 抗体l包括：肝炎病毒标志物检测 感染免疫检测 肿瘤标志物检测 自身抗体检测免疫学检测l非特异性功能检测：机体免疫状态实验室检测l血清免疫球蛋白检测l血清补体检测l细胞免疫检测第一节 血清免疫球蛋白检测l免疫球蛋白概念（Immunglobulin，Ig）l功能l分类： IgG、 IgA、 IgM 、IgE、 IgD免疫球蛋白G检测l特点：人体含量最多和最主要Ig，可通过胎盘l方法：单向免疫扩散法l参考值：7.616.6g/Ll临床意义： 1.IgG增高 （1）多克隆增高：感染、自身免疫病 （2）单克隆增高：MM 2. Ig降低：免疫缺陷、肾综、免疫抑制剂免疫球蛋白A检测l特点：分血清型与分泌型IgA（S Ig A）l方法：单向免疫扩散法l参考值：血清IgA： 7103350mg/L S IgA：不一致l临床意义 1.IgA升高：IgA型MM、肾病、自身免疫病 2.IgA降低：呼吸道感染、免疫缺陷病等免疫球蛋白M检测l特点：分子量最大Igl方法：单向免疫扩散法l参考值：0.482.12g/Ll临床意义1.IgM增高：肝炎肝硬化、自身免疫病2.IgM降低：免疫缺陷、免疫抑制剂、肾综免疫球蛋白D检测l特点：功能不明，与一些抗体产生有关l方法：Elisa法l参考值：0.62.0mg/Ll临床意义 1.IgD增高：MM、白血病 2. IgD降低：无丙种球蛋白血症免疫球蛋白E检测l特点：血清中最少，与变态反应有关l方法：Elisal参考值：0.10.9mg/Ll临床意义 1.增高：各种过敏性疾病、寄生虫感染、MM等 2.降低：免疫抑制剂、丙球缺乏症血清M蛋白检测l单克隆B细胞产生的免疫球蛋白及其分子片断l方法：蛋白电泳l参考值：阴性l临床意义：多发骨髓瘤 重、轻链病第二节 血清补体检测l补体成份：C1（C1q、C1r、C1s）C9、B、D、P、H、I等因子组成l功能： 1.参与免疫反应 2.免疫损伤作用总补体溶血活性检测l总补体溶血活性(CH50)：反应补体传统途径 的活化程度l方法：试管法l参考值：50100u/mll临床意义 1.减低：SLE、肾小球肾炎、肝病 2.增高：组织损伤、急性炎症补体C3检测l方法：单向免疫扩散法、免疫比浊法l参考值：1.140.27g/Ll临床意义 1.减低：SLE、急性肾小球肾炎、链球菌感 染后肾炎 2.增高：急性炎症补体C4检测l方法：单向免疫扩散法、免疫比浊法l参考值：0.55 0.11g/Ll临床意义：同C3第三节 细胞免疫检测l淋巴细胞l淋巴细胞分类：T、B淋巴细胞，第三群淋巴 细胞（NK、LAK）T细胞表面标志lT细胞受体l簇分化抗原l组织相容性抗原l致有丝分裂原受体l病毒受体T细胞免疫检测lT细胞花结形成试验lEaRFc、EsRFC、EtRFCl参考值：Ea为23.6 3.5%， Et为64.4 6.7%l临床意义 1.反映周围血中的T细胞数量 2.间接反应细胞免疫功能：降低主要见于免疫 缺陷性疾病如恶性肿瘤 3.有利于免疫缺陷性疾病的诊断和疗效观察T细胞免疫检测lT细胞转化试验：有丝分裂原（PHA）l临床意义 1.反映机体的细胞免疫水平，可作为免疫缺 陷病的辅助诊断 2.可用以估计疾病的疗效和预后 3.可协助选择适宜的移植供体T细胞免疫检测l白细胞分化抗原意义lT细胞分化抗原测定：CD3、CD4、CD8l临床意义 1.CD3降低：自身免疫病 2.CD4降低：恶性肿瘤、爱滋病、免疫抑制剂 3.CD8减低：自身免疫病 4.CD4/CD8比值变化意义B细胞表面标志l表面免疫球蛋白（SIg）lCD抗原lMHc抗原lFc受体l补体受体、丝裂原受体B细胞免疫检测lB细胞膜表面免疫球蛋白（SmIg）l临床意义： 1.检测外周血B细胞的百分率 2.SmIg降低：免疫缺陷病 SmIg增高：慢性淋巴细胞白血病B细胞免疫检测l红细胞抗体补体花结形成试验l临床意义 1.检测外周血B细胞数量及免疫功能 2.花结形成细胞降低：免疫缺陷性疾病 增高：淋巴增殖性疾病B细胞免疫检测lB细胞分化抗原测定：CD19、CD20为B细胞特有标志lCD19、CD20升高：淋巴细胞白血病lCD19、CD20降低：使用化疗或免疫抑制剂后第四节 病毒性肝炎血清标志物检测l乙型肝炎病毒标志l丙型肝炎病毒标志乙型肝炎病毒标志物检测l乙肝传染途径：垂直传播占3045% 水平传播占50 60% 乙肝病毒表面抗原（HBsAg）测定l方法：Elisa、RIAl参考值：阴性l临床意义：急性乙肝的潜伏期 持续阳性易发展慢性乙肝或肝硬化 乙肝病毒携带 本身不具有传染性乙肝病毒表面抗体（HBsAb）测定l参考值：阴性l临床意义：保护性抗体 感染后36个月出现，数年消失 注射乙肝疫苗后呈阳性，持续时间不等乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）测定l参考值：阴性l临床意义：乙型肝炎活动期 较强的传染性 垂直传播 持续阳性易转为慢性肝炎、肝硬化乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）测定l参考值：阴性l临床意义：HBV复制减少，传染性降低 非保持性抗体 乙肝病毒C抗体（HBcAb）测定l参考值：阴性l临床意义： IgM型HBcAb为近期感染HBV标志，传染性强 持续不降及高滴度，慢性肝炎 判断HBsAg阴性急性乙肝有意义 非保护性抗体乙肝两对半lHBsAglHBsAblHBeAglHBeAblHBcAb大三阳： HBsAg HBeAg HBcAb小三阳： HBsAg HBeAb HBcAb现症HBV感染lHBsAg（+）或HBeAg（+）lHBV-DNA（+）lHBcAbIgM（+）l肝内HBcAg（+）或HBsAg（+）或HBV-DNA（+）慢性乙型肝炎诊断l临床符合慢性肝炎+现症HBV感染之一慢性HBsAg携带l无临床症状及体征l肝功能正常lHBsAg血症持续6个月以上丙型肝炎（HCV）l传染途径：血液或血制品l诊断：血清抗-HCV阳性（IgM、IgG） HCV-RNA 甲、丁、戊、庚型肝炎见传染病学l自学有关部分第五节 感染免疫检测l抗体检测l抗原检测抗链球菌溶血素“O”测定l用已知抗原（溶血素“O”）检测抗体（ASO）l方法：免疫比浊法、胶乳凝集法l参考值：0 300IU/ml或阴性l临床意义 1.辅助诊断A族溶血性链球菌感染所致疾病 2.有利于鉴别诊断抗链球菌溶血素“O”测定l溶血性链球菌感染一周后，ASO升高，4-6周达高峰，可维持数周到数年l临床应动态观察，ASO逐渐升高或维持高水平，疾病活动，ASO逐渐下降，疾病缓解伤寒、副伤寒免疫测定l致病原：伤寒杆菌、副伤寒杆菌甲、乙、丙型l检测方法：肥达反应 酶联免疫吸附试验 胶原凝集试验伤寒、副伤寒免疫测定l肥达反应定义：已知抗原检测抗体，属直接凝集反应l伤寒杆菌抗原： （1）菌体抗原（O） （2）鞭毛抗原（H） （3）伤寒杆菌包膜抗原（vi）伤寒、副伤寒免疫测定肥达反应临床意义lO凝集效价1：80，H凝集效价1：160，或甲、乙、丙H凝集效价1：80有临床意义lO抗体IgM，H抗体为IgG，因抗体性质不同，影响肥达反应结果 （1）O效价上升，H效价不高，疾病早期 （2）H效价高，O效价不高，曾患伤寒或有接种史lO抗体不能区分伤寒、副伤寒，H可以l早期使用抗菌素或免疫抑制剂，肥达反应可为阴性伤寒、副伤寒免疫测定l酶联免疫吸附试验（Elisa）l目的检测物（O抗原）IgM抗体l临床意义 1.利于早期诊断 2.滴度1：20对诊断伤寒携带有帮助 3.敏感性、特异性优于肥达反应伤寒、副伤寒免疫测定l胶乳凝集法l目的检测物：伤寒、副伤寒沙门菌可溶性抗原l临床意义 1.早期诊断 2.其它抗体检查结果阴性时有意义结核分支杆菌抗体和DNA测定lElisa法、金标法测抗体lPCR法：检测结核分枝杆菌DNAl参考值：阴性l临床意义：可能结核分枝杆菌感染lPCR、血清学检测优缺点病毒感染免疫检测l人巨细胞病毒抗体和DNA测定巨细胞病毒抗体和DNA测定l病毒属性：疱疹病毒，可引起受染细胞变大l感染途径：先天、后天性l检测方法：间接免疫荧光、Elisa法、PCR-DNAl参考值：阴性l临床意义：IgM抗体阳性 IgG抗体阳性，4倍以上效价升高 PCR-DNA阳性 优生优育性传播疾病免疫检测l梅毒螺旋体抗体测定l人获得性免疫缺陷病毒抗体及RNA测定梅毒螺旋体抗体测定l梅毒：苍白螺旋体引起的一种性传播疾病，人是唯一传染源l人体受染后产生特异性抗体及非特异性抗体（反应素）梅毒螺旋体抗体检查l非特异性的类脂质抗原试验（筛选试验）l特异性的密螺旋体抗原试验（确证实验）梅毒螺旋体抗体试验l筛选试验（1）性病研究实验室试验（VDRL）（2）不加热血清反应素实验（USR）（3）快速血浆反应素实验（RPR）l原理：以类脂质检测非特异性抗体l临床意义：梅毒的筛选 非特异，假阳性率高梅毒螺旋体抗体试验l确诊试验（1）荧光螺旋体抗体吸收试验（2）梅毒螺旋体血凝试验l临床意义：肯定梅毒的诊断人获得性免疫缺陷病毒抗体及RNA测定lAIDS（Acquired immunodeficiency syndrom）获得免疫缺陷综合症l病原体：HIV-1、HIV-2，属逆转录病毒l抗体出现时间：感染HIV4-8周AIDS的实验室诊断l病毒检测：细胞培养分离病毒 抗原（P24）和逆转录酶检测 核酸检测(PCR)l抗体检测：筛选试验 确诊试验AIDS实验室诊断l筛选试验：Elisa 快速蛋白印迹法l确诊试验：蛋白印迹试验 RT-PCR法（免疫印迹不能确诊时用）第六节 肿瘤标志物检测l甲种胎儿球蛋白测定（AFP）l癌胚抗原测定（CEA）甲种胎儿球蛋白测定（AFP）l方法：放射免疫测定法l参考值：20ug/Ll临床意义 （1）孕妇，多300ug/L （2）原发性肝癌，80%300ug/L，10%阴性 （3）生殖腺胚胎癌，AFP含量升高 （4）肝炎、肝硬化，大多20200ug/L，随病情变化癌胚抗原测定l方法：放射免疫测定法l参考值： 15ug/Ll临床意义（1）结肠、胃、胰腺、肺及妇科肿瘤，CEA常升高（2）缺乏特异性，无早期诊断价值（3）CEA浓度随病情变化，可作为结肠癌术后复发的指标第七节 自身抗体的检测l一 类风湿因子的测定(rheumatoid factor,RF)l二 抗核抗体的测定(antinuclear antibodies,ANA)类风湿因子l一种抗人变性IgG的抗体，可与IgG的 Fc段结合l方法：胶乳凝集实验、ELISA、免疫比浊法l参考值：阴性l临床意义：1.在类风湿关节炎患者中检出率很高，与RA病情活动性及预后有一定关联2.其它风湿病及疾病也可出现低滴度RF3. 5%的正常人可出现低滴度阳性4.特异性不高，不作RA的筛选试验抗核抗体测定l 抗核抗体（Antinuclear antibodies,ANA）泛指抗各种核成分的抗体，无器官特异性和种属特异性，可与不同来源的细胞核反应。抗核抗体测定ANA的类型l抗DNA抗体：可分为两大类 (1) 抗天然DNA抗体，或抗双链DNA抗体 (2) 抗变性DNA抗体，或单链DNA抗体l抗组蛋白抗体l抗非组蛋白抗体，包括ENA抗体 l抗核仁抗体l抗其它细胞成份抗体抗核抗体测定方法：l免疫荧光法：检测总ANA抗体 a.周边型 b.均质型 c.斑点型 d.核仁型lELISA抗核抗体测定临床意义：lANA阳性可见于多种疾病。最常见于SLE、SD、MCTD等风湿病，也可见于其它疾病如肝炎lANA阳性应分清为哪一类ANA，如抗ENA、抗dsDNA抗体l不同底物，不同检测方法，ANA检测结果不同抗核抗体测定抗ENA抗体有如下几种：l抗核糖核蛋白（RNP）抗体：抗RNP抗体多见于混合性结缔组织病l抗Sm抗体：SLE的特异性标志抗体，但阳性率较低l抗SS-A抗体，主要见于SLE和SSl抗SS-B抗体，见于SSl抗ScL-70抗体，见于硬皮病抗双股DNA抗体测定l方法：间接免疫荧光试验l参考值：阴性l临床意义： 1.对确诊SLE和判断狼疮活动性参考价值大 2. 对SLE有较高特异性（95%），敏感性仅 70% 3.本抗体滴度高者常有肾损害 第八节 其他免疫检测l免疫复合物测定免疫复合物测定lC-反应蛋白（CRP）测定免疫复合物测定免疫复合物测定l免疫复合物是抗原抗体产物，存在于血液循环中为CIC，也可沉积于组织和器官，被单核吞噬细胞清除。l检测方法: （1）聚乙二醇沉淀法 （2）微量抗补体法 （3）C1q结合法免疫复合物测定CIC可能升高的病变原因l与内源性抗原有关 (1)变性IgG抗原， 如：RA (2)核抗原，如：SLE (3)特异的细胞抗原，如：肿瘤l与外源性抗原有关 (1)医源性抗原，如药物变态反应 (2)传染性微生物抗原，如：病毒性肝炎l抗原性质不明，如脉管炎 免疫复合物测定临床意义免疫复合物测定临床意义l增高：见于自身免疫病、感染、肿瘤、移植、变态反应等l诊断免疫复合物病如风湿病、慢性活动性肝炎、血管炎、肾小球肾炎等C-反应蛋白测定lCRP为一种急性时相蛋白l测定方法：用抗体测抗原。单向免疫扩散、火箭电泳、胶乳凝集、免疫比浊法等l参考值：定性阴性；定量0-10mg/LCRP测定临床意义lCRP升高：化脓性感染、组织坏死、恶性肿瘤、风湿病等l鉴别诊断：细菌与非细菌感染（病毒）、风湿热活动期与稳定期、器质性和功能性疾病谢谢6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXoXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6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