实验二实验二 、细菌革兰氏染色法、细菌革兰氏染色法一）实验目的：一）实验目的：1 1、学习并初步掌握革兰氏染色法；、学习并初步掌握革兰氏染色法；2 2、了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。、了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二）实验原理：二）实验原理： 革兰氏染色法是细菌学中的一个重要的鉴别染色法。按革兰氏染色法是细菌学中的一个重要的鉴别染色法。按照细菌对染色反应的不同，可以分为革兰氏阳性和革兰氏阴性照细菌对染色反应的不同，可以分为革兰氏阳性和革兰氏阴性菌两大类，两类染色反应的不同，表示它们的细菌组成物质性菌两大类，两类染色反应的不同，表示它们的细菌组成物质性质上的差异，也表明它们生理上的差异。革兰氏染色法对于细质上的差异，也表明它们生理上的差异。革兰氏染色法对于细菌的分类鉴定以及生产应用与医学诊断上都具有重要意义。菌的分类鉴定以及生产应用与医学诊断上都具有重要意义。 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色，当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫- -碘复合物，从而碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时细胞壁脱水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，细胞壁脱水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，由于其细胞壁舦聚糖层较薄，类脂含量较高，所以当脱色由于其细胞壁舦聚糖层较薄，类脂含量较高，所以当脱色处理时，类脂质被酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫处理时，类脂质被酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫- -碘碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。复染剂的红色。三、实验器材：三、实验器材：1 1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌2 2、染色剂：革兰氏染液、染色剂：革兰氏染液3 3、接种环、载玻片、酒精灯、洗瓶、显微镜、接种环、载玻片、酒精灯、洗瓶、显微镜、双层瓶、擦镜纸等双层瓶、擦镜纸等四、实验方法四、实验方法1、制片、制片 涂片涂片干燥干燥固定固定2、初染、初染滴加结晶紫染色滴加结晶紫染色12分钟，水洗；分钟，水洗；3、媒染、媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟；分钟；4、脱色、脱色滴加滴加95%酒精脱色，酒精脱色，25-30秒，立即水洗；秒，立即水洗；5、复染、复染用番红液复染约用番红液复染约2分钟，水洗；分钟，水洗；6、镜检、镜检干燥后，用油镜观察。干燥后，用油镜观察。图6 无菌操作过程图7 革兰氏染色程序1、结晶紫染1min2、水洗3、碘液媒染1min4、水洗5、乙醇脱色30秒6、水洗7、番红复染2min8、水洗9、吸水纸吸干实验结果：实验结果：1、绘出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的革兰氏染色视野图，并指、绘出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的革兰氏染色视野图，并指出哪种是革兰氏阳性菌，哪种是革兰氏阴性菌。出哪种是革兰氏阳性菌，哪种是革兰氏阴性菌。思考题：思考题：1、涂片后为什么要固定？固定时应注意什么、涂片后为什么要固定？固定时应注意什么/2、革兰氏染色过程中，哪些操作是成败关键？为什么？、革兰氏染色过程中，哪些操作是成败关键？为什么？