食品卫生微生物学检验菌落总数测定*菌落总数测定菌落的概念：菌落（colony）是指细菌在固体培养基上经培养后生长繁殖而形成的能被肉眼所识别的生长物集落，它是由数以万计的相同细菌集聚而成的。菌落总数的定义：样品经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)，所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。所得结果包括一群在方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧和兼性厌氧菌。卫生学意义：菌落总数主要作为判定样品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察样品中细菌的性质和繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学综合评价时提供科学依据。主要修订内容培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂。菌落计数公式进行了修改。添加了关于蔓延菌落的描述。添加了PetrifilmTM 细菌总数检验测试片法。添加了拍打式均质器或等效的设备。第一法 平板计数法培养基改变情况平板计数琼脂 （PCA)胰蛋白胨 酵母浸膏 葡萄糖 琼脂 蒸馏水 1000mL营养琼脂（NA)蛋白胨 牛肉膏氯化钠琼脂蒸馏水 1000mL样品处理添加了拍打式均质器或等效的设备关于均质器使用效果和对检测结果的影响，有不同的报道：uu不同食品样品采用不同的均质方法，测试结果不同 。uu不同的均质方式对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测的影响也不同。 菌落总数的检验程序图检样10倍系列稀释选择23个适宜样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养平皿内每皿内加入适量培养基(PCA)菌落计数36482h报告样品的稀释固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1min2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。按上述操作制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。根据对样品污染状况的估计，选择23个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。及时将15mL20mL冷却至46的平板计数琼脂培养基(可放置于461恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL）。培养琼脂凝固后，将平板翻转，361培养48h2h。水产品301培养72h3h。 菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，cfu）表示。选取菌落数在30cfu300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30cfu的平板记录具体菌落数，大于300cfu的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，则应将每条链（不同来源）作为一个菌落计。 结果的表述-菌落总数的计算方法若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值再将平均值乘以相应的稀释倍数，作为每g(ml)中的菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下列公式计算： N = C / n1 + (0.1 n2) (d)若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板上菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。菌落总数的报告 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约。大于或等于100时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可以用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约采用两位有效数字。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/mL为单位报告。菌落总数计算公式的改变统计学依据：平板菌落数越多，结果越具有代表性； （不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等）取样量越大，结果越具有代表性； （同等取样条件、排除其他方面的干扰因素）计算公式公式使用的前提：有两个连续稀释度在适宜计数范围内（30300个菌落数）N = C / n1 + (0.1 n2) (d) N ： 样品中菌落数C ：平板菌落数之和n1：适宜范围菌落数的第一稀释度（低）平板个数 n2：适宜范围菌落数的第二稀释度（高）平板个数d： 第一稀释度（低）计算范例稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）菌落数232，24433，35检样稀释：检样稀释时，应以无菌操作称取或量取有代表性在样品25g（25mL）置225mL灭菌稀释液中。固体样品应剪碎，以拍打式样品处理器做成样品悬液（1：10）。根据食品卫生标准和对样品污染情况的估计，再进行10倍递增稀释。注意每递增稀释一次，必须另换1支吸管，以保证样品稀释倍数的准确性。从吸管筒内取出灭菌吸管时，注意不要将管尖碰到手或其他沾污物可能触及的部位。（如玻璃瓶口、试管品、仍留在容器内的吸管的外露部分）。进行稀释时应注意取样的准确性。（如：吸入液体时应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将液体放至所需刻度。放液体时，不要让吸管接触稀释液的液面，可沿管壁放入，避免吸管外粘附的食品残渣进入稀释液体中）。平板接种与培养：根据食品卫生标准要求和对样品污染情况的估计，选择23个稀释度。加入样品时要注意外来的污染。培养基倾注的温度与厚度是实验正确与否的关键。（倾注的温度：一般3545，温度过高会造成已受损伤的菌细胞死亡。厚度：直径9cm的平皿一般要求1520mL培养基，若培养基太薄，在培养过程中可能因水分蒸发而影响细菌的生长）。为防止细菌增殖及产生片状菌落，在加入样液后，应在20min内倾注培养基。检样与培养基混匀时，可先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转。旋转中应防止混合物溅到皿边的上方。培养基凝固后，应尽快将平皿翻转培养，保持琼脂表面干燥，尽量避免菌落蔓延生长，影响计数。 为控制污染，在实验过程中，应在工作台上打开一块琼脂平板，其暴露时间应与检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长时间相当，然后与检样一同培养，以了解检样在操作过程中有无受到来自外界的污染。培养温度: 每种不同样品中的细菌都有一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及生理条件可能得出不同的结果，因而应根据检测标准的要求选择适当的培养温度和培养时间。食品：36， 482h 。饮用水：36， 48h 。水产品：30， 723h。 (36培养和30培养结果差别较大，同样水产品48h结果和72h也有差别。) 对照试验：检样的稀释液中往往带有食品颗粒，在这种情况下，为避免与细菌菌落混淆，可作一检样对照，不经培养，置4环境放置，在计数时用于对照。或可选用TTC营养琼脂作培养基。菌落计数：如果高稀释度平板上的菌落数比低稀释度平板上的菌落数高，则说明检验过程中可能出现差错或样品中含抑菌物质，这样的结果不 可用于结果报告。如果平板上出现链状菌落，菌落间没有明显的界限，这可能是琼脂与检样混匀时，一个细菌块被分散所造成的。一条链作为一个菌落计。若培养过程中遭遇昆虫侵入，在昆虫爬行过的地方也会出现链状菌落，也不应分开计数。如果平板上菌落太多，不能计数时，不能用多不可计作报告。应在最高稀释度平板上任意选取2个1cm2的面积，计算菌落数，除2求出每cm2面积内平均菌落数，乘以63.6(皿底面积cm2数)。如果检样是微生物类制剂（酸牛奶、酵母制酸性饮料等），在进行菌落计数时应将有关微生物（乳酸菌、酵母菌）排除，不可并入检样的菌落总数内作报告。在进行菌落计数时，检样中的霉菌和酵母菌也不应计数。第二法 PetrifilmTM 细菌总数试片法PetrifilmTM 细菌总数试片法原理：细菌具有脱氢酶能使相应的底物脱氢而释放出氢离子，培养基中的TTC作为氢离子的受体，在接受氢离子后被还原为红色非溶解性产物，从而使细菌着色，达到易观察、便计数的效果。优点：培养基具有良好的生产质量；菌落计数特别方便（容易判读），红色菌落，易于食品颗粒分开，无菌落重叠现象；方格设计，便于计数；菌落分布特别均匀；平行平板菌落结果一致性比较好，这与避免了培养基对细菌热损伤有关；菌落蔓延或半透明菌膜现象很少发生；安全方面：不像玻璃平皿易碎、对人员造成潜在的伤害，另外密封比较好，不容易直接接触。缺点：某些有红色颗粒的，需要注意；粘稠的液体样品，不易分散开；表面活性比较大，易流出；泡沫比较丰富的样品等颜色特别重的，如桔黄色，掩盖了菌落；抑菌剂浓度比较高时；辣根及辣根粉、大蒜及洋葱制品；某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象，大部分是芽胞杆菌。操作要点按菌落总数平板计数法的样品制备方法进行。样品匀液的pH值应在之间，pH值过低或过高时分别用1M NaOH或1M HCl予以调节。合理稀释度的选择，每稀释度接种2张测试片。接种时避免气泡产生。培养基未凝固时勿挪动。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20片。谢谢!