垂直板聚丙烯酰胺垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶脱氢酶同工酶（活性染色鉴定法）（活性染色鉴定法）实验目的：实验目的：v理解同工酶的概念及遗传学意义理解同工酶的概念及遗传学意义v学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理v掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术v掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色同工酶同工酶 是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达在不同组织中表达的蛋白质作用相同的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不但分子结构、理化特性等不同。同。 本实验做的是乳酸脱氢酶本实验做的是乳酸脱氢酶LDH的分离鉴定。的分离鉴定。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理 天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。 多数蛋白质的pH在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳； 对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称为阴极电泳。夹在两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶 电泳电泳缓冲液缓冲液 电泳电泳缓冲液缓冲液 加在槽中的样品加在槽中的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型 相同孔径的凝胶、缓冲系统，是利用蛋白质分子的主要靠电荷和分子筛效应进行分离。不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，浓缩效应，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。 不连续系统不连续系统连续系统连续系统一、动物组织的样品的获取二、试剂的配制、仪器的准备三、分离胶30分钟）四、浓缩胶20分钟）五、电泳2-3小时）六、染色30分钟）七、观察结果实验流程实验流程1.凝胶储备液：A储备液： pH8.9 TrisHCl缓冲液：1 M HCl 48ml，36.6g Tris，加 双蒸水到 80ml，调节pH到8.9定容到100ml。B储备液 ： pH6.7 TrisHCl缓冲液：1 M HCl 48ml，5.98g Tris，加双蒸水到80ml，调节pH到6.7定容到100ml。C储备液： 分离胶储备液30% Acr/Bis）：30g Acr，0.8g Bis，用双蒸水定容到100ml，备用，4存放可以保存1个月。D储备液： 浓缩胶储备液：16g Acr，4g Bis，用双蒸水定容到 100ml，备用，4可以保存1个月。E储备液： 10% ApsW/V）：1g定容到10ml，-20保管。 F储备液： 40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。TEMED一、试剂：一、试剂：2.电泳缓冲液：Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，运用 时稀释10倍。3.乳酸脱氢酶染色剂的配制1M 乳酸钠 0.5mlNAD 25mgPMS 2mgNBT 15mg0. 2M TrisHcl溶液PH8.02ml去离子水定容至50ml器材：器材：v 夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳压电源电压300-600V，电流50-100mA），移液枪各种量程），烧杯100mL），培养皿1.电泳槽2.梳子3.制胶器4.夹胶框封胶条1234v取材：鲫鱼若干条，解剖取眼、鳃、肺、肝、肠、肉、卵 、心脏，放入冰箱保存。v提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需4预冷，组织重量g与缓冲液体积mL之比为：5。用研钵研磨充分。浆液4离心约30分钟，15000转分钟。v取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加100ul 甘油和10ul溴酚蓝，混匀之后即可点样。二、样品的制备二、样品的制备三、分离胶的制备三、分离胶的制备储备液A储备液C储备液双蒸水E储备液TEMED总体积用量（ml）2.55.012.5100ul10ul20配方表配方表vTEMEDTEMED最后一个加入，最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速。胶高度距混匀，操作迅速。胶高度距样品凹玻璃板下品凹玻璃板下缘约1cm1cm，用移液，用移液枪在凝胶表面沿短玻板在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一加一层水以隔水以隔绝空气，空气，并使胶面平整。并使胶面平整。v水与凝固的胶面有折射率不同的界限，用水与凝固的胶面有折射率不同的界限，用滤纸吸去多余的水。吸去多余的水。四、浓缩胶的制备四、浓缩胶的制备vTEMED最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速。浓缩胶液高度到凹玻璃板下缘0.5cm左右，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。约30分钟后，凝胶完全。 v小心拔出样品梳两端同时向外拔）。储备液B储备液D储备液双蒸水F储备液E储备液TEMED总体积用量（ml）1.252.51.2560ul16ul10配方表配方表点样点样加样加样样品迁样品迁移方向移方向五、电五、电 泳泳 电压和电流：电压电压和电流：电压180V， 电流流电流流1830mA；溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。六、染色与观察六、染色与观察v揭去上面长型玻璃板，凝胶从短型玻璃板上剥离，慢慢地把胶板冲入白瓷盘或大培养皿内，避光于37度摇床中染30min。v观察拍照m m：肌肉：肌肉musclemuscle）；）；l l：肝：肝脏liverliver）；）；k k：肾脏kidneykidney）；）；s s：脾：脾脏spleenspleen）；）；h h：心：心heartheart）；）； e e：眼睛：眼睛eyeeye）；）；f f：鳍finfin）；）；g g：鳃gillgill）；）；b b：脑brainbrain）思考题：思考题：v根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？v为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？分为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？分别有何用途？别有何用途？v谢谢附：分离胶、浓缩胶配方附：分离胶、浓缩胶配方储备液液A A储备液液C C储备液液双蒸水双蒸水E E储备液液(APS)(APS)TEMEDTEMED总体体积用量用量（mlml）2.52.55.05.012.512.5100ul100ul10ul10ul2020储备液液B B储备液液D D储备液液双蒸水双蒸水F F储备液液E E储备液液(APS)(APS)TEMEDTEMED总体体积用量用量（mlml）1.251.252.52.51.21.25 560ul60ul16ul16ul1010