酵母RNA的提取1 1、实验目的、实验目的1 1、掌握稀碱法提取、掌握稀碱法提取RNARNA的原理和方法的原理和方法2 2、学习和了解其它提取、学习和了解其它提取RNARNA的方法和的方法和原理原理2、实验重点和难点离心机的使用提取RNA的实验原理3 3、实验原理、实验原理一般的生物细胞中同时含有DNA和RNA，在酵母中RNA比DNA的含量高得多， RNA（2.6710.0%），DNA则少于2(O.03O.516)，在实验室常用酵母作为RNA提取的材料。若要制备具有生物活性的RNA，可采用苯酚法、去污剂法和盐酸胍法等，最常用的是苯酚法提取RNA；若对生物活性没有要求，则可使用浓盐法，稀碱法等。工业中用稀碱法或浓盐法，主要用于制备核苷酸的原料.苯酚法：组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。浓盐法：在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA 释放出来，再利用等电点（pH为2.02.5）沉淀。此法易掌握，产品颜色较好。盐浓度需要控制，太低，RNA不易从细胞中释放出来，太高，细胞急剧收缩不利于抽提。一般80120g/L为宜。稀碱法稀碱法：利用细胞壁在稀碱条件下溶解，使RNA释放出来，这种方法提取时间短，但RNA 在稀碱条件下不稳定，容易被碱分解；本实验采用的稀碱，既可加速细胞的破裂，又可增大 RNA的溶解度。当碱被中和后，可用乙醇(或者异丙醇）将RNA沉淀，或用等电点沉淀RNA(应严格控制pH,缓慢调),此为 RNA的粗品。核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加和磷酸各组分。加硫酸硫酸煮沸可使其水煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的解，从水解液中可以测出上述组分的存在。存在。核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖碱基碱基水水解解（1 1）嘌呤碱嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。呤银化合物沉淀。（2 2）磷酸磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀磷钼酸铵沉淀(NH(NH4 4) )3 3POPO4 412MoO12MoO3 3,有还有还原剂存在时，形成蓝色钼蓝。原剂存在时，形成蓝色钼蓝。(NH(NH4 4)MoO)MoO4 4+H+H2 2SOSO4 4 H H2 2MoOMoO4 4+(NH+(NH4 4) ) 2 2SOSO4 4H H3 3POPO4 4+12H+12H2 2MoOMoO4 4 H H3 3P(MoP(Mo3 3O O1010) ) 4 4+12H+12H2 2O OH H3 3P(MoP(Mo3 3O O1010) ) 4 4 MoMo2 2O O3 3 MoOMoO3 3（钼蓝）钼蓝）还原产物钼蓝在波长还原产物钼蓝在波长660nm660nm测定吸光值，当测定吸光值，当无机磷含量在无机磷含量在125g 125g 范围内，光吸收和范围内，光吸收和含磷量成正比。含磷量成正比。 RNARNA的含磷量为的含磷量为9.5%9.5%，即，即1g RNA1g RNA磷磷相当于相当于10.5 10.5 gg RNA RNA。DNADNA的含磷量平均为的含磷量平均为9.9%9.9%。Vit C（3 3）地衣酚地衣酚( (苔黑酚）显色法苔黑酚）显色法：RNARNA与酸共与酸共热时降解，形成戊糖，继而形成糠醛（热时降解，形成戊糖，继而形成糠醛（-呋喃甲醛），糠醛与地衣酚（呋喃甲醛），糠醛与地衣酚（3 3，5-5-二羟基二羟基甲苯）反应，形成鲜绿色复合物，可用比甲苯）反应，形成鲜绿色复合物，可用比色法测定。当色法测定。当 核糖核酸浓度在核糖核酸浓度在 1010100g/ml 100g/ml 范围内，其浓度与吸光度成线范围内，其浓度与吸光度成线性关系需要性关系需要FeClFeCl3 3或或CuCu2+2+作催化剂。作催化剂。4、实验操作( (一一)RNA)RNA的提取的提取（1 1）称称5g5g干干酵酵母母粉粉于于150 150 mlml三三角角烧烧瓶瓶中中，加加25ml 25ml O.2O.2的的 NaOHNaOH，沸沸水水浴浴中中搅搅拌拌提提取取20 20 minmin。冷冷却却后后滴滴加加乙乙酸酸使使其其略略偏偏酸酸性，性，pHpH约约5-65-6，目的是去除蛋白质。，目的是去除蛋白质。（2 2）离心）离心(4000 r(4000 rminmin，13 min)13 min)，去除沉淀。上清液冰浴。，去除沉淀。上清液冰浴。（3 3）向向上上清清液液中中加加入入20 20 mlml（约约上上清清液液的的两两倍倍体体积积）9595乙乙醇醇，稍稍搅搅拌拌后后静静置置（冰冰浴浴约约10min10min）。待待完完全全沉沉淀淀后后离离心心(4000 (4000 r rminmin，15 min) 15 min) ，去上清液。，去上清液。（4 4）沉淀用）沉淀用9595乙醇洗两次（如沉淀浮起需再次离心），每乙醇洗两次（如沉淀浮起需再次离心），每次约次约10mL;10mL;用乙醚洗两次，每次用乙醚洗两次，每次10mL10mL。目的是去除脂溶性物质。目的是去除脂溶性物质和水，乙醚的沸点比乙醇的低，所以最后加乙醚有利于沉淀的和水，乙醚的沸点比乙醇的低，所以最后加乙醚有利于沉淀的干燥。干燥。( (二二)RNA)RNA的鉴定的鉴定 取沉淀约1g，加10 ml 10H2SO4沸水浴中加热30 min。（5 5）嘌呤碱）嘌呤碱 取水解液取水解液2mL2mL加入加入2mL2mL浓氨水，浓氨水，然后加入约然后加入约1mL 5%1mL 5%硝酸银溶液，观察有无嘌呤硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。（慢慢加入嘌呤碱时，沉碱的银化合物沉淀。（慢慢加入嘌呤碱时，沉淀上浮，摇匀，沉淀下沉）淀上浮，摇匀，沉淀下沉）（6 6）核糖）核糖 取取1 1支试管加入水解液支试管加入水解液0.5mL0.5mL、1mL1mL苔黑酚三氯化铁浓盐酸溶液。放沸水浴中苔黑酚三氯化铁浓盐酸溶液。放沸水浴中2 2分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。时间久了会有黑色沉淀，是浓度高，产物在。时间久了会有黑色沉淀，是浓度高，产物结晶出来了。结晶出来了。5 5、注意事项、注意事项避开磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围避开磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围20207070，防止，防止RNA RNA 降解。在降解。在9090100100条件下加热条件下加热可使蛋白质变性，破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶，可使蛋白质变性，破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶，有利于有利于RNA RNA 的提取。的提取。在调在调pH pH 值时，一定要缓慢小心，且要在低温下进值时，一定要缓慢小心，且要在低温下进行。行。在洗涤时，要用乙醇洗涤，且不可用水洗，否则在洗涤时，要用乙醇洗涤，且不可用水洗，否则将导致将导致RNA RNA 部分溶解而造成损失，降低部分溶解而造成损失，降低RNA RNA 提取提取率。率。 提取提取 RNA RNA 时必须用沸水浴，并经常搅拌，时必须用沸水浴，并经常搅拌，NaOHNaOH 必须实现预热。必须实现预热。 用乙酸调用乙酸调 pH5pH56 6 必须有，目的可以除去一些必须有，目的可以除去一些杂质。杂质。 最后过滤前必须将乙醇沥干，不能带水，否则最后过滤前必须将乙醇沥干，不能带水，否则 RNA RNA 会粘在滤纸上，会粘在滤纸上， 无法取下。也可以采用无法取下。也可以采用离心的方法。离心的方法。所得所得 RNA RNA 粗品应是浅黄色粉末状。粗品应是浅黄色粉末状。 6、原始数据记录实验过程中的现象7、讨论7.1、用稀碱法提取酵母RNA的过程中需注意什么？7.2、鉴定RNA的原理？