细胞培养细胞培养 及其及其 在肿瘤研究中的应用在肿瘤研究中的应用 1一、细胞培养基础知识一、细胞培养基础知识（一）概念（一）概念 细胞培养是在严格的无菌操作条件下，从机体组织分离出细胞，在体外用无菌的培养液及孵箱模拟机体的生理条件，进行细胞离体培养，使之存活和繁殖。其关键是要求严格的无菌和培养条件。 2 （二）培养细胞的特性（二）培养细胞的特性 1、细胞的生长方式及类型、细胞的生长方式及类型 (1)(1)贴附生长型细胞贴附生长型细胞贴附生长型细胞贴附生长型细胞 能附着于支持物表面生长的细胞。能附着于支持物表面生长的细胞。 上皮细胞型：上皮细胞型：形态类似上皮细胞的多种培养细形态类似上皮细胞的多种培养细 胞，来源于外胚层及内胚层。胞，来源于外胚层及内胚层。 成纤维细胞型：成纤维细胞型： 起源于中胚层起源于中胚层 。 （2 2） 悬浮生长型细胞悬浮生长型细胞悬浮生长型细胞悬浮生长型细胞 3 2、培养细胞的生长过程、培养细胞的生长过程 （1 1）单个细胞的生长过程）单个细胞的生长过程）单个细胞的生长过程）单个细胞的生长过程 细胞周期：细胞周期：细胞周期：细胞周期： 一一个个母母细细胞胞分分裂裂结结束束后后形形成成的的细细胞胞至至其其下下一一次次再再分分裂裂结结束束形形成成两两个个子子细细胞胞的的这这段段时时期期，可可分为间期和分为间期和MM期（分裂期）两个阶段。期（分裂期）两个阶段。 细胞周期细胞周期细胞周期细胞周期 = = 间期间期间期间期 + + MM期期期期 = = GG1 1期期期期 + + S S期期期期 + + GG2 2期期期期 + + MM期期期期 4（2 2）细胞系的生长过程）细胞系的生长过程）细胞系的生长过程）细胞系的生长过程 细胞系细胞系细胞系细胞系 有限（生长）细胞系有限（生长）细胞系有限（生长）细胞系有限（生长）细胞系 56原代培养或初代培养期原代培养或初代培养期 为新鲜组织自体内取出后首次在体外培养为新鲜组织自体内取出后首次在体外培养至第一次传代的时间，一般约至第一次传代的时间，一般约1-41-4周。原代培养周。原代培养是建立各种细胞系的第一步。是建立各种细胞系的第一步。 7 原代培养的细胞刚刚离体，生物学特性未原代培养的细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传物性（二倍发生很大变化，仍具有二倍体遗传物性（二倍体核型）。原代培养的细胞与体内相应的细胞体核型）。原代培养的细胞与体内相应的细胞性状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及性状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性质，适合作药物测试、细胞分化等组织特异性质，适合作药物测试、细胞分化等实验研究。实验研究。 原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需对细如要做较为严格的对比性实验研究，还需对细胞进行短期传代后进行。胞进行短期传代后进行。 8传代期（细胞系阶段）传代期（细胞系阶段） 将原代细胞分开接种至将原代细胞分开接种至2 2个或更多的新培个或更多的新培养器皿中，即传代。每进行一次分离再培养为养器皿中，即传代。每进行一次分离再培养为传一代。这种传代大约数天至传一代。这种传代大约数天至1 1周左右即可重周左右即可重复一次，持续数月，此即细胞系。复一次，持续数月，此即细胞系。 传代期的细胞增殖旺盛，一般仍然是二倍传代期的细胞增殖旺盛，一般仍然是二倍体核型，并保留原组织细胞的很多特征。体核型，并保留原组织细胞的很多特征。 9衰退期衰退期增殖变慢增殖变慢停止分裂停止分裂 传代中偶尔可有极少后代细胞能通过“危机期”，获得不死性而具有持久或无限增殖的能力，这种细胞即称为无限无限细胞系或连续（生长）细胞系细胞系或连续（生长）细胞系。10（3 3） 每代细胞的生长过程每代细胞的生长过程每代细胞的生长过程每代细胞的生长过程11 （三）细胞培养的基本设备和材料（三）细胞培养的基本设备和材料1、细胞培养室的设置、细胞培养室的设置 无菌操作 孵 育 制 备 清 洗 消毒灭菌处理 储 藏122、基本设备、基本设备 （1）超净工作台超净工作台 水平式或外流式 垂直式或侧流式 （2）二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱（3）倒置显微镜倒置显微镜13（4）常用的消毒的培养器皿常用的消毒的培养器皿 玻璃培养瓶、培养皿 塑料培养瓶、培养皿 微载体 涂膜材料 中空纤维 14（5）培养液培养液 培养基培养基 天然培养基：天然培养基： 胎牛血清 新生牛血清 灭活处理：灭活处理：加温到56，30min 5 %5 %血清血清 保护细胞保护细胞 10% 10%血清血清 细胞生长细胞生长 15% 15%血清血清 融合及克隆融合及克隆 20% 20% 血清血清 冻存细胞冻存细胞15合成培养基：合成培养基： 基本成分基本成分常用种类常用种类 RPMI1640 Eagle培养液 （MEM） BME（Basal Eagle Medium） DMEM（Dulbcco MEM） 16 培养用液培养用液 水、平衡盐溶液、消化液、缓冲液、维生素液及用于检测的各种染液等。（6）细胞冷冻储存器细胞冷冻储存器 17二、肿瘤细胞培养和应用二、肿瘤细胞培养和应用 18（一）细胞培养在肿瘤研究中的应用及意义（一）细胞培养在肿瘤研究中的应用及意义 1、探索各种化学的、物理的和生物的因子 在肿瘤生命活动中的作用（单一的与综 合的作用）及过程。192、提供基础，便于在分子生物学水平上对 细胞进行各项研究，尤其由于可获得纯 的均一性细胞，故可进行分子杂交、电 泳等研究。3、便于研究肿瘤细胞的结构和功能，尤其 便于研究单个细胞的结构。其中包括扫 描与透射电镜的研究。 204 4、培养细胞可长期保存及传代，以便观察、培养细胞可长期保存及传代，以便观察 肿瘤细胞遗传行为的改变。肿瘤细胞遗传行为的改变。5 5、观察研究肿瘤的生物学行为及机制，如、观察研究肿瘤的生物学行为及机制，如 侵袭转移。侵袭转移。 6 6、建立肿瘤细胞体外分化诱导模型。、建立肿瘤细胞体外分化诱导模型。 7 7、可用于快速筛选抗癌药物以及用于致癌、可用于快速筛选抗癌药物以及用于致癌 物、促癌剂、抗促癌剂的研究。物、促癌剂、抗促癌剂的研究。 21（二）（二）肿瘤细胞的取材和培养肿瘤细胞的取材和培养 1、肿瘤细胞的取材、肿瘤细胞的取材 （1）实体瘤手术标本取材注意事项）实体瘤手术标本取材注意事项 切取未经任何治疗和没有坏死的标本切取未经任何治疗和没有坏死的标本 无菌操作处理无菌操作处理 标本及早浸入无血清培养液保鲜并及标本及早浸入无血清培养液保鲜并及 时进行培养时进行培养 22（2）体腔液标本的取材体腔液标本的取材（3）血液标本取材血液标本取材 以外周血中的肿瘤细胞为培养对象以外周血中的肿瘤细胞为培养对象抗抗抗抗 凝凝凝凝 去除去除去除去除RBCRBC 离离离离 心心心心 悬浮培养悬浮培养悬浮培养悬浮培养 232、培养方法、培养方法 （1）组织块培养法组织块培养法 将组织剪切成小块后，接种于培养 瓶。 适合于组织量少的原代培养。 24（2）酶消化法酶消化法 结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分散的方法，获得的细胞制成悬液可直接进行培养。 适用于培养大量组织，原代细胞产量高。 胰蛋白酶法胰蛋白酶法 胶原酶法胶原酶法 EDTA EDTA法法（二乙烯四乙酸二钠）（二乙烯四乙酸二钠） （3）机械分散法）机械分散法 直接用机械方法进行组织细胞分散。 25 3、传代肿瘤细胞培养的注意事项、传代肿瘤细胞培养的注意事项 （1）当癌细胞还没有生长到足以覆盖培 养瓶壁的大部分表面以前，应当耐 心等待，不要急于传代。 （2）从原代开始到10代左右期间，操作 慎重，确定适合该细胞的培养方法 （3）在早期传代培养，应适当提高接种 细胞密度。26（4） 对增殖能力极低的细胞，可根据细胞 种类不同选用不同的促生长物质。应 用饲养细胞。 （5） 对癌细胞分离，进行选择性传代，消 除成纤维细胞 。27（三）培养中的细胞转化及肿瘤细胞（三）培养中的细胞转化及肿瘤细胞 转化转化（transformation） 恶性转化恶性转化（malignant transformation） 常见特点：常见特点： 1 1、获得无限增殖能力或称之为永生性、获得无限增殖能力或称之为永生性、获得无限增殖能力或称之为永生性、获得无限增殖能力或称之为永生性 （immortalityimmortality） 2 2、产生了致癌性、产生了致癌性、产生了致癌性、产生了致癌性 3 3、生长密度依赖性、生长密度依赖性、生长密度依赖性、生长密度依赖性（density-dependencedensity-dependence）减低减低减低减低28 4 4、停泊依赖性、停泊依赖性、停泊依赖性、停泊依赖性（anchorage- dependenceanchorage- dependence）丧失丧失丧失丧失 5 5、血清依赖性降低、血清依赖性降低、血清依赖性降低、血清依赖性降低 6 6、 其它其它其它其它 形态改变形态改变 、核型改变，对外源凝集素如、核型改变，对外源凝集素如ConAConA的凝集能力增强，对化学致癌物毒性作用的凝集能力增强，对化学致癌物毒性作用的抵抗力增强，纤维粘连蛋白的抵抗力增强，纤维粘连蛋白（fibronectinfibronectin）合合成减少以及胞质内成减少以及胞质内cAMPcAMP水平降低等。水平降低等。 29（四）培养肿瘤细胞的生物学鉴定（四）培养肿瘤细胞的生物学鉴定 目的：目的： 证明培养细胞是否来自原来的癌瘤细胞；证明培养细胞是否来自原来的癌瘤细胞；证明培养细胞是否来自原来的癌瘤细胞；证明培养细胞是否来自原来的癌瘤细胞； 说明肿瘤组织类型；说明肿瘤组织类型；说明肿瘤组织类型；说明肿瘤组织类型； 描述肿瘤细胞的生物学特性。描述肿瘤细胞的生物学特性。描述肿瘤细胞的生物学特性。描述肿瘤细胞的生物学特性。30 常用培养肿瘤细胞的生物学检查项目如下：常用培养肿瘤细胞的生物学检查项目如下：1 1、组织起源、组织起源、组织起源、组织起源22、形态学观察、形态学观察、形态学观察、形态学观察33、细胞生长特性、细胞生长特性、细胞生长特性、细胞生长特性 细细胞胞生生长长曲曲线线、细细胞胞分分裂裂指指数数、倍倍增增时时间间及及细胞周期等。细胞周期等。 4 4、软琼脂培养、软琼脂培养、软琼脂培养、软琼脂培养 31 5 5、细胞核型分析、细胞核型分析、细胞核型分析、细胞核型分析 核核型型特特点点、染染色色体体数数量量，有有无无标标记记染染色色体体、染色体带型等。染色体带型等。 6 6、动物致瘤试验、动物致瘤试验、动物致瘤试验、动物致瘤试验77、组织化学检查、组织化学检查、组织化学检查、组织化学检查88、其他生物学特性检测、其他生物学特性检测、其他生物学特性检测、其他生物学特性检测32