杏仁蛋白质提取及功能特性研究概述杏仁蛋白质提取及功能特性研究概述 西北农林科技大学西北农林科技大学杏仁的概述杏仁的概述蛋白质提取分离蛋白质提取分离结构及功能性研究结构及功能性研究 前景展望前景展望杏仁的概述杏仁的概述杏仁杏仁(Semen armeniacae amarae)(Semen armeniacae amarae)是蔷薇科李属植物杏是蔷薇科李属植物杏或山杏的种子，杏仁呈扁心形，长或山杏的种子，杏仁呈扁心形，长 1cm1cm1.5cm 1.5cm ，宽约宽约1cm1cm，种皮红棕色或深黄色口，种皮红棕色或深黄色口1 1。杏仁分为甜杏。杏仁分为甜杏仁和苦杏仁两种，苦杏仁主要作为药物使用，甜杏仁和苦杏仁两种，苦杏仁主要作为药物使用，甜杏仁则可直接食用或用于食品加工。仁则可直接食用或用于食品加工。杏仁具有丰富的营养价值和良好的药用价值，中国医杏仁具有丰富的营养价值和良好的药用价值，中国医学科学院卫生所编著的食物成分表学科学院卫生所编著的食物成分表显示显示 ：每：每 100g100g杏仁中含蛋白质杏仁中含蛋白质 25g25g27g27g，油脂，油脂 47g47g56g56g，碳水化合物及粗纤维含量约占碳水化合物及粗纤维含量约占12g12g19g19g，还含有钙、，还含有钙、磷、铁、硒等多种元素和磷、铁、硒等多种元素和V V、硫胺索、核黄索、尼、硫胺索、核黄索、尼克酸、抗坏血酸等多种维生素。其中，硒含量为克酸、抗坏血酸等多种维生素。其中，硒含量为 27.6mg27.6mglO0glO0g，硒具有提高机体免疫力和延长寿命，硒具有提高机体免疫力和延长寿命的作用。杏仁的药用价值也非常高，保健功效很高。的作用。杏仁的药用价值也非常高，保健功效很高。 蛋白质提取分离蛋白质提取分离u碱溶酸沉法碱溶酸沉法 （1）工艺流程）工艺流程 原料预处理原料预处理粉末状原料粉末状原料碱溶液提取碱溶液提取定时间定时间(也可重复数次也可重复数次) 取上清取上清液液调调pH至蛋白质等电点沉淀至蛋白质等电点沉淀离心分离离心分离干燥干燥蛋白质产品蛋白质产品 （2）优缺点）优缺点 提取时间长，提取温度高，能源消耗大，而且提取效果较差。提取时间长，提取温度高，能源消耗大，而且提取效果较差。u酶法提取酶法提取 （1）工艺流程）工艺流程 原料预处理原料预处理加水加水加酶加酶调调pH值和温度值和温度蛋白质酶解蛋白质酶解灭酶灭酶冷却冷却离心离心收集上清液收集上清液沉淀蛋白质沉淀蛋白质水洗水洗干燥干燥蛋白质。蛋白质。 （2 2）优缺点）优缺点 提取具有时间短、反应条件温和，提取率高，而且酶价格相对便宜，适合提取具有时间短、反应条件温和，提取率高，而且酶价格相对便宜，适合于大规模的工业化生产于大规模的工业化生产蛋白质提取分离蛋白质提取分离u反胶束法反胶束法 （1）工艺流程）工艺流程 杏仁前处理杏仁前处理杏仁粉杏仁粉振荡增溶振荡增溶反胶束溶液反胶束溶液低速离心分离低速离心分离前萃液前萃液振荡振荡离心分离离心分离杏仁油；杏仁蛋白液杏仁油；杏仁蛋白液脱盐脱盐真空冷冻干燥真空冷冻干燥蛋白粉蛋白粉 （2）优缺点）优缺点 工艺过程短，能耗低，而且蛋白质不易变性。工艺过程短，能耗低，而且蛋白质不易变性。u盐碱两步浸提法盐碱两步浸提法 （1）工艺流程）工艺流程 杏仁粉稀盐液浸提杏仁粉稀盐液浸提碱液浸提碱液浸提离心离心盐析盐析再离心再离心透析透析干干燥燥蛋白质产品蛋白质产品 （2 2）优缺点）优缺点 总提取率较高，而且产品色泽好总提取率较高，而且产品色泽好蛋白质提取分离蛋白质提取分离u冷榨法冷榨法 （1）工艺流程）工艺流程 杏仁预处理杏仁预处理烘干烘干冷榨冷榨蛋白饼蛋白饼粉碎粉碎软水浸泡软水浸泡磨浆磨浆分渣分渣浓浓缩缩配料配料均质均质杀菌杀菌喷雾干燥喷雾干燥筛粉筛粉杏仁蛋白粉杏仁蛋白粉 （2）优缺点）优缺点 制备的蛋白质没有使用化学物质，保持了蛋白质的固有风味和天然性质制备的蛋白质没有使用化学物质，保持了蛋白质的固有风味和天然性质u分离蛋白的提取分离蛋白的提取 （1）工艺流程）工艺流程 杏仁杏仁粉碎粉碎研磨研磨加入加入 25倍蒸馏水倍蒸馏水磁力搅拌器搅拌磁力搅拌器搅拌1h离心离心 ，取，取上清液上清液将上清液的将上清液的pH调至调至4.5离心离心用蒸馏水洗沉淀用蒸馏水洗沉淀用用NaOH调节调节pH至至7.0真空冷冻真空冷冻 干燥干燥分离蛋白分离蛋白 （2 2）优缺点）优缺点 杏仁分离蛋白是纯度很高的蛋白质，适合用于杏仁蛋白质的电泳分析和杏仁分离蛋白是纯度很高的蛋白质，适合用于杏仁蛋白质的电泳分析和各种功能特性的研究分析。各种功能特性的研究分析。蛋白质提取分离蛋白质提取分离u超临界超临界CO2流体萃取在蛋白质提取前的处理流体萃取在蛋白质提取前的处理 （1）工艺流程）工艺流程 杏仁杏仁粉碎粉碎称量称量定量定量萃取筒中萃取萃取筒中萃取脱脂脱杂脱色的蛋白质。脱脂脱杂脱色的蛋白质。 （2）优缺点）优缺点 操作方便，选择性好，脱脂率高，兼有脱色脱杂脱异味的作用操作方便，选择性好，脱脂率高，兼有脱色脱杂脱异味的作用u排除法排除法 （1）工艺流程）工艺流程 脱脂脱脂脱脂杏仁粉脱脂杏仁粉粉碎粉碎洗涤洗涤离心分离离心分离干燥干燥杏仁浓缩蛋白质。杏仁浓缩蛋白质。 （2 2）优缺点）优缺点 蛋白质提取率高，性质稳定，副产品可综合利用蛋白质提取率高，性质稳定，副产品可综合利用蛋白质提取分离蛋白质提取分离u其他蛋白质制备方法其他蛋白质制备方法 除了上述应用于杏仁蛋白的提取方法，参考其他植物蛋白的制备，除了上述应用于杏仁蛋白的提取方法，参考其他植物蛋白的制备，可以应用在杏仁蛋白质的提取方法还有很多，如：膜分离技术可以应用在杏仁蛋白质的提取方法还有很多，如：膜分离技术 (依据依据大豆蛋白的分子量采用高分子膜对蛋白液进行截流浓缩来制取的方法大豆蛋白的分子量采用高分子膜对蛋白液进行截流浓缩来制取的方法)、超声波增溶提取法、三氯乙酸等有机溶剂法。、超声波增溶提取法、三氯乙酸等有机溶剂法。 结构及功能性研究结构及功能性研究u氨基酸组成氨基酸组成 结构及功能性研究结构及功能性研究u氨基酸组成氨基酸组成 甜杏仁蛋白含有人体所需的甜杏仁蛋白含有人体所需的18 种氨基酸。必需氨基种氨基酸。必需氨基酸与总氨基酸的比值酸与总氨基酸的比值(EAA，rAA) 约为约为 30(未包括色氨未包括色氨酸酸)。所有氨基酸中，谷氨酸含量最高约占氨基酸总量。所有氨基酸中，谷氨酸含量最高约占氨基酸总量的的 28，谷氨酸是人体内重要的氨基酸，参与多种生理，谷氨酸是人体内重要的氨基酸，参与多种生理活动物质的合成，同时也是使食物味道鲜美的重要呈味物活动物质的合成，同时也是使食物味道鲜美的重要呈味物质。由化学评分可知，甜杏仁蛋白的氨基酸组成中苏氨酸质。由化学评分可知，甜杏仁蛋白的氨基酸组成中苏氨酸含量较少，赖氨酸和含硫氨基酸的含量略低于参考模式。含量较少，赖氨酸和含硫氨基酸的含量略低于参考模式。 结构及功能性研究结构及功能性研究u蛋白组成分析蛋白组成分析 经过水、盐、乙醇、碱的连续提取后，得到的可溶性蛋白中，清经过水、盐、乙醇、碱的连续提取后，得到的可溶性蛋白中，清蛋白为主要成分，占蛋白为主要成分，占 7777 左左 右，其次为谷蛋白，球蛋白和醇溶右，其次为谷蛋白，球蛋白和醇溶蛋白含量较低；除醇溶蛋白外，其余三种蛋白的纯度均较高。蛋白含量较低；除醇溶蛋白外，其余三种蛋白的纯度均较高。 结构及功能性研究结构及功能性研究u功能性质功能性质 （1）溶解度）溶解度 甜杏仁蛋白的等电点约为甜杏仁蛋白的等电点约为45，在碱性环境下的溶解度明显高于，在碱性环境下的溶解度明显高于酸性条件下，酸性条件下，pH=9时溶解度约为时溶解度约为80。 （2）吸水性及吸油性）吸水性及吸油性 甜杏仁蛋白的吸水和吸油能力均优于大豆分离蛋白。甜杏仁蛋白的吸水和吸油能力均优于大豆分离蛋白。 （3）乳化性及乳化稳定性）乳化性及乳化稳定性 结构及功能性研究结构及功能性研究u功能性质功能性质 （4）起泡性及泡沫稳定性）起泡性及泡沫稳定性 大豆分离蛋白的超出量高于甜杏仁蛋白，随着时大豆分离蛋白的超出量高于甜杏仁蛋白，随着时间的延长，两者的超出量均明显下降间的延长，两者的超出量均明显下降 ，15min15min时，时，两者泡沫体积减少约两者泡沫体积减少约5050，表明这两种蛋白泡沫，表明这两种蛋白泡沫稳定性相似，但大豆分离蛋白的起泡性较好。稳定性相似，但大豆分离蛋白的起泡性较好。结构及功能性研究结构及功能性研究u功能性质功能性质 （5）表面疏水性）表面疏水性 甜杏仁蛋白的表面疏水性指数为甜杏仁蛋白的表面疏水性指数为1641648686，大于大，大于大豆分离蛋白的表面疏水性指数豆分离蛋白的表面疏水性指数5.575.57，这意味着甜，这意味着甜杏仁蛋白有更多的非极性残基定向于油水界面，杏仁蛋白有更多的非极性残基定向于油水界面，由于疏水相互作用在表面形成疏水性空穴，因而由于疏水相互作用在表面形成疏水性空穴，因而显示较好的乳化性。显示较好的乳化性。结构及功能性研究结构及功能性研究u功能性质功能性质 （6）热分析）热分析 蛋白质变性是食品加工过程蛋白质变性是食品加工过程中蛋白质最常见的变化之一，中蛋白质最常见的变化之一，差示量热扫描法差示量热扫描法 (DSC) (DSC) 自自2020世纪世纪 6060年代以来在国内年代以来在国内外已经广泛被用于蛋白质的外已经广泛被用于蛋白质的热变性研究。在热变性研究。在 DSCDSC谱图中，谱图中，最大峰对应的温度是变性温最大峰对应的温度是变性温度峰面积是变性焓。变性温度峰面积是变性焓。变性温度代表蛋白质的热稳定性而度代表蛋白质的热稳定性而焓变则反映蛋白质分子的聚焓变则反映蛋白质分子的聚集程度，峰的宽窄也可说明集程度，峰的宽窄也可说明这种变性转变的协同性。热这种变性转变的协同性。热分析常用的方法还有热重法分析常用的方法还有热重法(TGA)(TGA)，测定质量随温度的，测定质量随温度的变化情况主要反映蛋白质的变化情况主要反映蛋白质的热稳定性。热稳定性。 结构及功能性研究结构及功能性研究u功能性质功能性质 （7）抗氧化性）抗氧化性 采用采用A1calaseA1calase蛋白酶水解杏仁蛋白，以水解度蛋白酶水解杏仁蛋白，以水解度(DH)(DH)及水解产物对血管紧张素及水解产物对血管紧张素转化酶转化酶(ACE)(ACE)的抑制率为指标进行酶解工艺优化。结果表明，较大活性的的抑制率为指标进行酶解工艺优化。结果表明，较大活性的ACEACE抑制肽的最佳水解条件为：抑制肽的最佳水解条件为：pHpH值值7 70 0，温度，温度5050，酶底比，酶底比4 4，底物质量分，底物质量分数为数为2 2。该条件下经。该条件下经60 min60 min水解，其水解度为水解，其水解度为12122323，得到，得到ACEACE抑制肽的抑制肽的IC50IC50值为值为0 085mg85mgmLmL。结构及功能性研究结构及功能性研究u功能性质功能性质 （7）降血脂功能）降血脂功能 为研究杏仁蛋白对血脂的影响，先用盐析法从山杏仁中提取杏仁蛋白，为研究杏仁蛋白对血脂的影响，先用盐析法从山杏仁中提取杏仁蛋白，并用胰蛋白酶水解部分杏仁蛋白，然后采用大鼠脂代谢紊乱模型进行动物实并用胰蛋白酶水解部分杏仁蛋白，然后采用大鼠脂代谢紊乱模型进行动物实验。选用初体重验。选用初体重 1 00g左右的左右的wj Star大鼠在实验环境下适应大鼠在实验环境下适应 4d后，以体重后，以体重无差异分成无差异分成5组组 (每组每组6只只)：对照组、蛋：对照组、蛋 白组和水解组。每组在试验期间白组和水解组。每组在试验期间 自自由摄入高脂饲料，经由摄入高脂饲料，经 口定量口定量 (500mgkgd，每只大鼠，每只大鼠)给予水或杏仁蛋给予水或杏仁蛋 白、白、杏仁蛋白水解物杏仁蛋白水解物 1 0d，然后禁食，然后禁食 1 6h，心脏取血，测定血清总胆固，心脏取血，测定血清总胆固 醇、甘醇、甘油三酯、高密度脂蛋油三酯、高密度脂蛋 白胆白胆 固醇、低密度脂蛋固醇、低密度脂蛋 白胆白胆 固醇水平。结果表明，固醇水平。结果表明，杏仁蛋杏仁蛋 白具有显著降低血脂作用，杏仁蛋白水解产物的降血脂的作用更明显白具有显著降低血脂作用，杏仁蛋白水解产物的降血脂的作用更明显一些。一些。 前景展望前景展望 杏仁蛋白质中氨基酸含量丰富而且种杏仁蛋白质中氨基酸含量丰富而且种类齐全，构成比例接近于国际参考模类齐全，构成比例接近于国际参考模式，是很好的植物蛋白质资源。已有式，是很好的植物蛋白质资源。已有资料报道杏仁蛋白质具有优良的功能资料报道杏仁蛋白质具有优良的功能特性，是良好的食品添加剂。因此，特性，是良好的食品添加剂。因此，随着对杏仁的进一步开发，研究杏仁随着对杏仁的进一步开发，研究杏仁蛋白质的提取利用具有积极的经济和蛋白质的提取利用具有积极的经济和现实意义。现实意义。 植物蛋白质的提取和含量测定植物蛋白质的提取和含量测定一、实验目的一、实验目的 掌握大豆蛋白的提取及制备大豆蛋白掌握大豆蛋白的提取及制备大豆蛋白丙酮干粉的方法。丙酮干粉的方法。二、实验原理二、实验原理1.1.大豆蛋白主要是酸性蛋白，大豆蛋白主要是酸性蛋白，pI 4.5-5.0pI 4.5-5.0，能溶于碱溶液，能溶于碱溶液 本实验先利用稀碱提取大豆蛋白，再利用丙酮结合等电点溶解度最低原理沉淀蛋白。2. Folin-2. Folin-酚法测定蛋白质含量酚法测定蛋白质含量 酚试剂由两部分组成，试剂A为双缩脲试剂，可与肽链发生显色反应，试剂B中的磷钼酸和磷钨酸在OH-条件下不稳定，易被酚类化合物还原显蓝色，因蛋白质中含Tyr被还原成蓝色，颜色深浅与浓度成正比，可用比色法测定。三、实验器材三、实验器材1.分光光度计（500nm），比色皿2.计算纸（9 cm9 cm）3.离心机 （离心管100ml 、50ml）4.组织捣碎机5.精密pH试纸pH 0.5-5.0; pH 4.5-7.0四、实验试剂四、实验试剂1.大豆干粉 2. 0.2%NaOH 3. 丙酮 （预冷）4. 6M HCl，1M HCl5 标准 BSA（0.5 mg/ml）6. Folin酚试剂甲（用前组分一: 组分二 = 50:1）（1） 1克 Na2CO3和0.2克 NaOH溶解于50毫升蒸馏水中。（2） 0.5克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解100毫升 1%酒石酸钾钠 （KNaC4H4O64H2O）中。 每次使用前，将50ml（1）与1ml（2）混合，即为试剂甲。四、实验试剂四、实验试剂7. Folin酚试剂乙酚试剂乙 （用前稀释一倍）（用前稀释一倍）在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。五、实验步骤五、实验步骤（一）蛋白提取（一）蛋白提取1.1.称取称取3 3克大豆干粉，加入克大豆干粉，加入0.2%NaOH 300.2%NaOH 30毫升。（先加入调成糊状，再用少毫升。（先加入调成糊状，再用少量多次地慢慢地加入（边加边搅拌），室温下搅拌抽提量多次地慢慢地加入（边加边搅拌），室温下搅拌抽提10min10min，于，于4000r/min4000r/min离离心心7min ,7min ,小心留取上清液，弃脂层和沉淀，如上清液有漂浮物，再经过滤；小心留取上清液，弃脂层和沉淀，如上清液有漂浮物，再经过滤；2. 2. 留出上清液留出上清液2 2毫升稀释毫升稀释5050倍做含量测定（第二步）倍做含量测定（第二步）3.3.制干粉：制干粉： 量剩余上清液的体积，加入等体积预冷丙酮，先用量剩余上清液的体积，加入等体积预冷丙酮，先用6mol/L6mol/L的的HClHCl调调pHpH至至6.06.0，再用，再用1mol/L1mol/L的的HClHCl小心调小心调pHpH至至4.5-5.04.5-5.0，于，于4000r/min4000r/min离心离心15min15min，( (留取沉留取沉淀物淀物) )，并用少量丙酮反复，并用少量丙酮反复( (至少两次至少两次) )搅拌洗涤（在离心管中进行），加入丙搅拌洗涤（在离心管中进行），加入丙酮后一定将沉淀搅拌充分，使沉淀脱水。得到白色粉末状的大豆蛋白粉，用干酮后一定将沉淀搅拌充分，使沉淀脱水。得到白色粉末状的大豆蛋白粉，用干净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入4040度烘箱干燥，待整个实验结束后，再度烘箱干燥，待整个实验结束后，再称重并计算产率称重并计算产率（即（即3 3克大豆干粉中蛋白含量）克大豆干粉中蛋白含量）。五、实验步骤五、实验步骤（二）蛋白含量测定（二）蛋白含量测定1. 1. 制作标准曲线制作标准曲线按照下表操作，以按照下表操作，以A500nmA500nm为纵坐标，以蛋白含量为横坐标建立标曲。为纵坐标，以蛋白含量为横坐标建立标曲。2. 2. 测定提取第测定提取第2 2步稀释后样品的蛋白浓度步稀释后样品的蛋白浓度 按上表中样品列操作，根据按上表中样品列操作，根据A500nmA500nm查找含量，并计算原始浓度。查找含量，并计算原始浓度。 THANK YOU