第七章第七章 氧化复原氧化复原酶13学学时 一、一、过过氧氧化物酶化物酶主要主要内内容：容： 二、多二、多酚氧酚氧化酶化酶一、过氧化物酶一、过氧化物酶PODPeroxidase过氧化物酶是存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶。催化由过氧化氢参与的各种复原剂的氧化反响。过氧化物酶是由单一肽链与一个铁卟啉辅基结合构成的血红蛋白。多数植物过氧化物酶与碳水化合物结合成为糖基化蛋白。糖蛋白有防止蛋白酶降解和稳定蛋白构象的作用。 1过氧化物酶作用方式及分布过氧化物酶作用方式及分布1.1过氧化物酶作用方式过氧化物酶作用方式 过氧化物酶供体：过氧化氢过氧化物酶供体：过氧化氢 氧化复氧化复原酶催化过氧化氢分解时，同时有氢供原酶催化过氧化氢分解时，同时有氢供体参与。体参与。 H2O2+ AH2 2H2O+A酚类、胺类化合物、某些杂环化合物和一些无机离子等都可以作为过氧化物酶的供氢体。 1.2过过氧化物氧化物酶酶的分的分类类 1 含含铁过铁过氧化物氧化物酶酶正正铁铁血血红红素素过过氧化物氧化物酶酶：含有正：含有正铁铁血血红红素素 羟羟高高铁铁血血红红素素 为辅为辅基，存基，存在于高等植物、在于高等植物、动动物和微生物中。物和微生物中。绿过绿过氧化物氧化物酶酶：绿过绿过氧化物氧化物酶酶的的辅辅基也含有一个基也含有一个铁铁原原卟卟啉基啉基团团，这类这类酶酶存在于存在于动动物器官和乳中物器官和乳中 乳乳过过氧化氧化氢氢酶酶 。 2 黄蛋白黄蛋白过过氧化物氧化物酶酶：含有黄素腺：含有黄素腺嘌嘌呤二核苷酸作呤二核苷酸作为辅为辅基，基，这类这类酶酶存在存在于微生物和于微生物和动动物物组织组织中。中。 1.分布：分布：过过氧化物氧化物酶酶在植物在植物细细胞中以两种方式胞中以两种方式存在：存在：以可溶方式存在于以可溶方式存在于细细胞胞浆浆中中以以结结合方式在合方式在细细胞中与胞中与细细胞壁或胞壁或细细胞器相胞器相结结合合 辣根是过氧化物酶最重要的一个来源。辣根中20%的过氧化物酶POD与细胞壁结合，用2mol/L NaCl(高离子强度)才干提取出来。辣根中过氧化物酶活力为569,000单位/g组织蘑菇仅240单位/g组织。 2 过氧化物酶在食品加工中的运用过氧化物酶在食品加工中的运用速冻蔬菜速冻蔬菜2 过氧化物酶的活力与果蔬产品，特别是非酸性蔬菜在保藏期间构成的不良风味有关。1 过氧化物酶是果蔬成熟和衰老的目的。如苹果气调贮藏中，过氧化物酶出现两个峰值，一个在呼吸转机成熟，一个在衰老开场。3 过氧化氢酶属于最耐热的酶类，在果蔬加工中常被当作热处置能否充分的目的。 方方法法：将将已已热热处处置置的的原原料料中中抽抽取取样样品品，横横切切，随随即即放放入入愈愈创创木木酚酚或或联联苯苯胺胺溶溶液液中中，然然后后取取出出，在在切切面面上上滴滴0.3%H2O2，数数分分钟钟后后，用用愈愈创创木木酚酚处处置置的的样样品品变变为为褐褐色色，联联苯苯胺胺变变为为深深蓝蓝色色，阐阐明明过过氧氧化化氢氢酶酶未未被被破破坏坏，热热处处置置时时间间不不够够，假假设设均均不不变变色，那么表示热处置效果良好。色，那么表示热处置效果良好。POD的测定方法：的测定方法： 3过氧化物酶最适过氧化物酶最适pH和最适温度和最适温度3.1最适最适pH过过氧化物氧化物酶酶普通都含有多种同功普通都含有多种同功酶酶，因此最适因此最适pH范范围较宽围较宽。酸性形状，酸性形状，过过氧化物氧化物酶酶血血红红素和蛋素和蛋白白质质部分分部分分别别，酶酶蛋白从天然形状蛋白从天然形状转变转变到可逆到可逆变变性形状，活力下降，且性形状，活力下降，且热稳热稳定定性低；性低；在中型和碱性形状，在中型和碱性形状，酶酶处处于天然形于天然形状，蛋白状，蛋白质质构造含构造含螺旋构造，螺旋构造，稳稳定，定，酸化后酸化后螺旋构造破坏，螺旋构造破坏，产产生生构造。构造。如青刀豆：如青刀豆：pH5.0-5.4，有可溶，有可溶态态，离子离子结结合，共价合，共价结结合。合。 3.2 最适温度最适温度差差别较别较大：大：35-60。不同来源的不同来源的过过氧化物氧化物酶酶在最适作用温度在最适作用温度上存在着很大的差上存在着很大的差别别。例如，。例如，马铃马铃薯薯和花菜和花菜 均均浆浆 中中过过氧化物氧化物酶酶的最适温度的最适温度分分别为别为55和和3540。 4过氧化物酶的热稳定性过氧化物酶的热稳定性4.1. 热失活概念双向性：POD中含有不同的耐热性质部分，不耐热部分在热处置时很快地失活，而耐热部分在同样的温度缓慢地失活。 在在88热处置置时甜玉米中甜玉米中过氧化物氧化物酶的失活的失活 用用邻-苯二胺作苯二胺作为氢体底物体底物测定定酶活力活力 可逆性：经热处置后的酶液在室温或较低温度下保藏，它的活力部分可以再生。例如：辣根过氧化物酶在70 加热1小时后，在30 下再生的酶活力可到达处置前的30-40%，而在50 下不能再生，如再降低到40 时，酶活力又开场提高。 4.2. 过氧化物酶冷冻增活效应过氧化物酶冷冻增活效应果蔬热烫后，有多少剩余活力或再果蔬热烫后，有多少剩余活力或再生活力被允许留在被保藏的产品中，剩余生活力被允许留在被保藏的产品中，剩余酶活力在冰冻保藏后，质量比酶完全失活酶活力在冰冻保藏后，质量比酶完全失活时要高。时要高。速速冻蔬菜能否永久保藏？蔬菜能否永久保藏？ 4.3. 非脂肪氧合酶作用非脂肪氧合酶作用在热失活中过氧化物酶分子聚集成寡聚体，在热失活中过氧化物酶分子聚集成寡聚体，分子量添加一倍，这个过程包括酶分子展开和展分子量添加一倍，这个过程包括酶分子展开和展开的酶分子进一步堆积，血红素基暴露，添加了开的酶分子进一步堆积，血红素基暴露，添加了血红素蛋白非酶催化脂肪氧化的才干，导致不良血红素蛋白非酶催化脂肪氧化的才干，导致不良风味的产生，这一过程非脂肪氧合酶作用热烫风味的产生，这一过程非脂肪氧合酶作用热烫钝化。钝化。 问题：经热烫的罐装或冷冻蔬菜在保藏期问题：经热烫的罐装或冷冻蔬菜在保藏期间产生的不良风味的缘由？间产生的不良风味的缘由？ 5 影响过氧化物酶热失活的要素影响过氧化物酶热失活的要素5.1. 不同来源的不同来源的POD具有不同的耐具有不同的耐热热性。性。普通来普通来说说，植物的，植物的过过氧化物氧化物酶酶活力越高，活力越高，它的耐它的耐热热性也越高。性也越高。比如比如马铃马铃薯和花菜匀薯和花菜匀浆浆中的中的过过氧化物氧化物酶酶在在95加加热热10min就完全而不可逆地失活。就完全而不可逆地失活。而甘而甘蓝蓝中的中的过过氧化物氧化物酶酶在在120加加热热10min依然有依然有0.3%活力保管下来。活力保管下来。 5.2. 低水分含量，低水分含量，POD耐热性添加：耐热性添加：例如：水分含量低于例如：水分含量低于40%时，谷类中过氧时，谷类中过氧化物酶的热稳定性与水分含量成反比。化物酶的热稳定性与水分含量成反比。对于加工脱水果蔬有重要参考价值。对于加工脱水果蔬有重要参考价值。 5.3. 外加要素：降低外加要素：降低pH，添加，添加NaCl浓浓度。度。以辣根中以辣根中过过氧化物氧化物酶酶为为例，参与例，参与羟羟高高铁铁血血红红素素能降低能降低酶酶的的热热失活速度失活速度(pH 7.0、76)而升高温度能提高而升高温度能提高酶酶的的热热失活速度。失活速度。在在pH7时时酶酶热热失活的速度最低，在失活的速度最低，在pH 4.0和和pH10时时酶酶热热失活的速度分失活的速度分别别提高到提高到8倍和倍和2倍。倍。酶酶失活的初速度正比于失活的初速度正比于NaCl的的浓浓度度(pH7.0、NaCl浓浓度低于度低于0.6mo1L)，糖能提高苹果和梨中糖能提高苹果和梨中过过氧化物氧化物酶酶的的热稳热稳定性。定性。 5.4. 加热方式：加热方式：pH确定，确定，T确定，确定，T变长，变长，导致酶失活后能够性变大，导致酶失活后能够性变大，HTST易导致酶易导致酶再生。再生。 5.5. 结合处置：结合处置： 微波和离子照射能降低在热烫过程中使微波和离子照射能降低在热烫过程中使酶失活所需的热处置强度。酶失活所需的热处置强度。微波处理沸水处理1.5min3min2min2min1min5min马铃薯过氧化物酶的微波处置完全失活所需的时间马铃薯过氧化物酶的微波处置完全失活所需的时间 辐射处置辐射处置在采用结合处置时，先运用辐射处置，再运用热处置。辐射时酶分子的聚集和单体的改性而使酶的热稳定性显著降低，且不会出现活力再生辐射诱导水产生自在基二次进攻的结果。 6 化学试剂对过氧化氢酶的影响化学试剂对过氧化氢酶的影响6.1. 使POD失活的作用方式：与酶结合失活作用于底物或产物 6.2. 化学化学试剂试剂种种类类6.2.1 SO2和和亚亚硫酸硫酸盐盐：SO2的作用的作用仅仅仅仅是破坏是破坏H2O2 SO2+ H2O 2H2O+SO30.1-0.15%的焦的焦亚亚硫酸硫酸盐盐能防止豌豆能防止豌豆产产生不良生不良风风味味 6.2.2 氰化物、叠氰化物和氟复合物：能与血红素结合，为可逆抑制。6.2.3 外表活性化合物：如单甘脂，卵磷脂等，显著失活。6.2.4 高分子物质：假设胶在pH5.5时，使POD显著失活；pH低，使POD完全失活。果胶的存在还能使POD最适pH从5.5挪动至8.0，大多数果胶pH在酸性范围。这在食品加工中很重要。二、二、 多酚氧化酶多酚氧化酶 多酚氧化酶邻二酚：氧氧化复原酶；E1,10,3,1在植物界乃至动物界分布广泛，由于其检测方便，是被最早研讨的几类酶之一。 引起食品酶促褐变的主要酶类引起食品酶促褐变的主要酶类果蔬食品在加工及贮藏过程中存在褐变反响，而褐变的缘由有非酶性的和酶性的，多酚氧化酶是引起食品酶促褐变的主要酶类，因此研讨多酚氧化酶的特性对制定食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。 有害：新颖、冷冻、干制和罐藏产品的褐变。有利：红茶消费，苹果浓缩汁除涩三要素：底物、O2、酶 1多酚氧化酶在自然界的分布多酚氧化酶在自然界的分布1广广泛泛存存在在于于自自然然界界，植植物物、微微生生物物及及动动物物器器官官。植植物种类不同，含量变化很大。果蔬中以橄榄含量最高。物种类不同，含量变化很大。果蔬中以橄榄含量最高。2PPO在在植植物物细细胞胞中中分分布布取取决决于于种种类类和和年年龄龄，果果蔬蔬而而言还取决成熟度，如线粒体，叶绿体。言还取决成熟度，如线粒体，叶绿体。3PPO在在果果蔬蔬的的不不同同部部分分含含量量存存在在很很大大差差别别。大大多多数数水水果果中中PPO以以结结合合形形状状存存在在。葡葡萄萄皮皮中中PPO活活力力高高，葡葡萄成熟时萄成熟时PPO活力下降幅度最大。活力下降幅度最大。 2 多酚氧化酶催化的反响及其作用底物多酚氧化酶催化的反响及其作用底物2.1.催化反响：两类反响都需求有分子氧参与。催化反响：两类反响都需求有分子氧参与。 (1) 一元酚羟基化：蘑菇中单酚。一元酚羟基化：蘑菇中单酚。 (2) 邻二酚氧化，生成邻醌。邻二酚氧化，生成邻醌。 多酚氧化酶催化的氧化反响的最初产物邻醌将继续变化。相互作用生成高分子量聚合物。与氨基酸或蛋白质作用生成高分子络合物。氧化哪些氧化复原电位较低的化合物，生成无色化合物。 其中导致褐色素的生成，反响的产物是无色的。 2.2.作用底物作用底物2.2.1 果蔬中四类 儿茶素 3,4二羟基肉桂酸酯 3,4二羟基苯丙氨酸 酪氨酸 2.2.2 特点PPO的最正确底物并非和酶同时存在于同一植物中。 PPO只能催化在对位上有一个大于CH2的取代基的一元酚羟基化，即PPO对底物具有特异性要求。不同的种类果蔬，同一种类不同部位中PPO具有不同的底物特性。多酚氧化酶在植株幼嫩阶段及生长旺盛期活性最高。 3 pH对多酚氧化酶活力的影响对多酚氧化酶活力的影响PPO的最适pH4-7之间动摇。不同种类，同一种果蔬不同种类的PPO，具不同最适pH。不同部位，pH也有差别。酶的提取或分别方法对最适pH也有影响。测定酶活力时，采用的底物和缓冲液对酶最适pH有影响。能够存在同工酶，PPO具有一个最适pH外，能够有第二个最适pH。 4 温度对多酚氧化酶活力的影响温度对多酚氧化酶活力的影响酶活力最适温度逐渐提高降低，如桃中PPO，从3开场随温度升高，至37最高，后下降。不同底物表现出不同的PPO酶活力最适温度：如马铃薯，底物为儿茶素，最适温度22。底物为焦醅酚，最适温度1535，线性上升。热失活温度70-90/短时间。低温形状酶失活是可逆的。微量的多酚氧化酶也能导致果蔬褐变，冷冻食品消费中热处置是必要的。 5多酚氧化酶抑制效应多酚氧化酶抑制效应酶促褐变三要素：酶，底物，O2。为什么柑桔榨汁后不会什么柑桔榨汁后不会发生生酶促褐促褐变？ 1对酶的抑制：对酶的抑制：PPO以铜为辅基的金属蛋白，金属螯合物，如抗坏血酸、柠檬酸、EDTA、果胶、氰化物。 2与酶催化生成的反响产物作用与酶催化生成的反响产物作用 同邻二酚氧化产物醌作用的复原剂，如抗坏血酸、SO2、偏重亚硫酸盐。 醌巧合剂：与醌作用，生成稳定的无色化合物，如半胱氨酸、谷胱甘肽、SO2、偏重亚硫酸盐。 3去除酶作用的底物去除酶作用的底物与酚类底物作用的化合物：PVPP聚乙烯吡咯烷酮与酚剧烈缔合，消去底物。无甲醛啤酒的消费隔氧 4 热烫处置灭酶 6光照强度与多酚氧化酶活性光照强度与多酚氧化酶活性多酚氧化酶属于植物体内的末端氧化酶系统，光照明显促进了此酶的活性。不同光照条件下海带体内酚类化合物含量的结果阐明，在01200 Lx(勒克斯)间，PPO随光照强度添加而呈上升趋势。在对玫瑰组织培育的研讨中，采用不同的遮光处置(对照、单层膜、双层膜)，其结果也同样证明在一定的光照强度变化幅度内，PPO活性和接种后的褐变率均随光强添加而上升。另外在茶叶研讨中也有与此相一致的报道。 7 多酚氧化酶的激活剂多酚氧化酶的激活剂 多酚氧化酶的作用会导致食品褐变。长期以来，防止食品的酶促褐变是一个重要的研讨课题。食品界在多酚氧化酶的抑制剂方面作了很多的研讨任务，而对于它的激活剂相对地了解较少。 阴离子洗涤剂，例如SDS (十二烷基磺酸钠) ，能有效激活多酚氧化酶。假设苹果经PVP(聚乙烯毗咯烷酮)处置，其果皮的多酚氧化酶便会失活，但用SDS处置后又能将已失活的酶激活。SDS能激活以潜在的方式存在于粗提取液中的多酚氧化酶。 假设用酸或脲素短时间地处置葡萄中的多酚氧化酶，能使酶可逆地激活；假设用酸处置作用时间较长，会导致酶不可逆地激活。另外Cu2+和底物3，4二羟基苯丙氨酸对一些果蔬来源的多酚氧化酶也有激活作用。 8 多酚氧化酶在果品和蔬菜中的生理作用多酚氧化酶在果品和蔬菜中的生理作用1起氧的缓冲剂作用；2为抵抗病原菌提供一定程度的维护作用由于PPO反响产物的反响才干大；3酚类物质氧化产物与细胞成份的相互作用，使组织不易受病虫害侵噬；4酶活性的降低标志果实达成熟阶段，适口性添加，种子积累开场。谢谢