o实验设计用酶o深圳绿微康生物工程有限公司 LVK-H100ohttp:/www.leveking.com/cn/product-detail-211.html详细介绍Chapter 7Enzymatic catalysis in Non-aqueous system酶的非水相催化酶的非水相催化Contents of chapter 71、酶催化反应的介质2、有机介质反应体系 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 GoGoGoGo5、酶非水相催化的应用 Go1 1 酶催化反应的介质酶催化反应的介质水是酶促反应最常用的反应介质。水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物许多有机化合物(底物底物)在水介质中难溶或不溶。在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？是否存在非水介质能保证酶催化？o1984年，克利巴诺夫（年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。 Zaks,A.and Kilbanov,A.M(1984),Science224,1249-1251oZoKs,A. and Kilbanov,A.M.(1985),Proc.Natl,Acad, 82,3192-3196酶工程除了如在固定化、定点突变、定向进化不断发酶工程除了如在固定化、定点突变、定向进化不断发展取得进步之外，近展取得进步之外，近20年来最大的突破就是在反应介年来最大的突破就是在反应介质方面。质方面。酶非水相催化的几种类型本章目录o有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化有机溶剂有机溶剂o 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。o气相介质中的酶催化气相介质中的酶催化气相介质气相介质o 酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。o超临界介质中的酶催化超临界介质中的酶催化超临界流体超临界流体o 酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。 o离子液介质中的酶催化离子液介质中的酶催化o 酶在离子液中进行的催化作用。离子液离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。 2 2 有机介质反应体系有机介质反应体系 o单相共溶体系单相共溶体系与水互溶的有机溶剂与水互溶的有机溶剂极性较大的有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。 酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。不存在传质障碍。 极性大的溶剂对一般酶的催化活性影响大，能在该体系反应的酶较少。不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。 o两相两相/ /多相体系多相体系与水不溶性，非极性有机溶剂与水不溶性，非极性有机溶剂o由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。o游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机相o催化反应在两相界面进行，一般适用于底物或产物两者或其中一种是属于疏水化合物的催化反应o微水介质体系微水介质体系非极性有机溶剂非极性有机溶剂o用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。o酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。o有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系。o微量的水主要是酶分子的结合水，对于维持酶分子的空间构象和催化活性至关重要。o另一有部分水分配在有机溶剂中。o(正正)胶束体系胶束体系o是在大量水溶液中含有少量与水不溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。o表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂抱在液滴内部o反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界面中进行。o反胶束体系反胶束体系o含有表面活性剂与少量水的有机溶剂系统o反向微团：疏水尾部向外，与非极性有机溶剂接触，急性头部向内，形成一个极性核o反应时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部，催化反应在两相的界面中进行。有机介质酶催化的优点o有利于疏水性底物的反应：有机溶剂增加了疏水性底物的溶解度，增加了疏水性物质的转化效率；o可改变反应平衡的移动方向：在有机介质中，可发生水解反应的逆反应，如氨基酸合成肽o能催化在水中不能进行的反应：转酯反应；酚氧化在氯仿中比水中效率高；o防止水引起的副反应发生；o酶稳定性增强，较少微生物污染；o易于实现固定化以及产物和酶的回收6.3 酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性o底物特异性o立体选择性o区域选择性o键选择性o热稳定性o活性opH底物特异性、立体选择性底物特异性、立体选择性o有机介质中，酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。o有机介质是某些酶的专一性发生变化，是酶活性中心构象刚性增强的结果。o酶促反应底物专一性的本质是由于酶能利用其与底物结合能和酶与水分子之间的结合能的差值o从热力学角度看，底物专一性改变的原因是由于溶剂的改变导致底物在有机溶剂与酶的活性中心之间的分配系数发生了改变。o不同的有机溶剂具有不同的极性，故不同的有机介质中，酶的底物专一性也不一样。o如：枯草芽孢杆菌蛋白酶催化N-乙酰-L-丝氨酸乙酯和N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯与丙醇的转酯反应。在二氯甲烷或苯的介质中，含丝氨酸的底物优先反应；在吡啶或季丁醇中，含苯丙氨酸的底物先发生转酯反应。o一般，在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易反应；反之。立体选择性o有机溶剂中酶的立体选择性降低。原因：o1. 在水和有机溶剂中，底物的两种对映体将水从酶分子疏水性结合位点上置换出来的能力有所不同。o2. 在疏水性差的溶剂中，疏水性的基团进入酶的疏水袋中比暴露在溶剂中热力学平衡更为有利，因此酶分子中的亲核基团易于进攻位置合适的底物分子的羟基，从而得到某个构型的产物。而在疏水性强的溶剂中，疏水性基团更倾向于暴露在溶剂中，而非进入酶的疏水袋，从而失去酶对底物的选择性。o疏水性强的介质中，D-异构体比L-异构体更容易与酶结合反应。应用于手性药物制造区域选择性o在酶促反应中，底物某一位置上的基团被选择性地转化而另一位置上的相同基团没有被转化的现象o随溶剂的改变而改变，(溶剂的疏水性改变，引起区域基团与酶活性中心的改变类似于立体选择性)键选择性o与酶的来源和有机介质的种类有关。o与氢键参数有关，易于形成氢键的基团，不易进行反应。反之易于反应。活性o有机溶剂直接作用于酶o有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度达到最大值；o低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保持，但也有某些酶活性亦发生变化。酶活性丧失的原因o热稳定性热稳定性o酶在缺水的环境中，使得酶分子中肽键水解、二硫键破坏、氨基酶在缺水的环境中，使得酶分子中肽键水解、二硫键破坏、氨基酸异构化等无法进行，酶构象的刚性增加，稳定性提高。酸异构化等无法进行，酶构象的刚性增加，稳定性提高。o如：胰脂肪酶催化的反应如：胰脂肪酶催化的反应o酶在非水介质中的稳定性还与介质中的水含量有关。如酶在非水介质中的稳定性还与介质中的水含量有关。如RNase在在非水介质中的水含量从非水介质中的水含量从0.06g/g增加到增加到0.2g/g蛋白质时，酶半蛋白质时，酶半衰期从衰期从120min减少到减少到50min反应体系对酶酯化反应的影响反应体系含1-三甲基硅-1-乙醇10 mM，戊酸10 mM，内标正十五烷，脂肪酶50 mg，30，120 rpm条件下振荡反应1：水饱和正已烷10 ml，2pH7.2缓冲液5 ml+正已烷10 ml某些某些酶酶在有机介在有机介质质与水溶液中的与水溶液中的热稳热稳定性定性 酶 介质条件 热稳定性猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯水， pH7.0T1/2 26 hT1/2 2 min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/2 =1.5 hT1/2 2 min脂蛋白脂肪酶甲苯，90，400 h活力剩余40胰凝乳蛋白酶正辛烷，100水，pH 8.0, 55T1/2 = 80 minT1/2 = 15 min枯草杆菌蛋白酶正辛烷，110T1/2 = 80 min核糖核酸酶壬烷，110，6 h水，pH 8.0, 90活力剩余95T1/2 24 hT1/2 10 min限制性核酸内切酶 （Hind ）正庚烷，55，30d活力不降低-葡萄糖苷酶2-丙醇，50，30 h活力剩余80溶菌酶环己烷，110水T1/2 =140 minT1/2 = 10 min本章目录o最适最适pHopH对水相中进行的酶促反应有较大影响，但在有机相反应体系中，很难直接测定。o在非水相反应中，酶所处的pH环境与酶在直接干燥、冻干或吸附到载体之前的缓冲液的pH相同，即酶对它所在的最后一个水溶液的pH有记忆能力，从缓冲液中获得的酶在微水体系中可以保持原先pH环境下的构象，酶的可电离基团在一定的pH中获得某一电离状态后，将它干燥或冻干后再加入到微水体系中，还会保持这一状态，从而影响酶在有机相中的催化活性。6.4 6.4 有机介质中酶催化反应的条件及其控制有机介质中酶催化反应的条件及其控制 o酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。o主要应控制的条件有n水含量n酶的种类和浓度n底物的种类和浓度n有机溶剂的种类n温度npHn离子强度本章目录水含量对酶催化反应的影响水含量对酶催化反应的影响o酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象空间构象、酶的催化活性催化活性、酶的稳定性稳定性、酶的催化反应速度催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和底物和反应产物的溶解度反应产物的溶解度有关。 o酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。水分子通过氢键、疏水作用、范德华力等维持酶分子构象。o在绝对无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。o酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。o维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential wateressential water）。o必需水与酶分子结构和性质有密切关系。不同的酶所要求的必需必需水与酶分子结构和性质有密切关系。不同的酶所要求的必需水的量差别很大。水的量差别很大。o有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水最适水含量含量。o辛烷介质中，酶分子糜蛋白酶只需50分子水就可维持其活性；氯仿中，酶分子多酚氧化酶需要3.5*107水分子。o无水条件下，酶分子表面的带电基团和极性基团相互作用，使得酶构象“锁定失活”。即有机溶剂低介电常数使得蛋白质基团之间更强的静电作用。o低于必需水的下限，酶构象变化失活；o在水量增加情况下，酶也会因水分过多而活性降低。o活性最大：蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性(柔性)之间达到最佳的平衡点。o微水介质体系中含水量o在有机介质中含有的水，主要有2类o一类，与酶分子紧密结合的水o一类，溶解在有机溶剂中的游离水o一般，最适含水量随着溶剂极性的增加而增加。o最佳含水量o通常在有机溶剂中对于酶的催化活性存在一最佳含水量o含水量低于最佳值时，酶的构象过于刚性而无法表现催化活性；含水量高于最佳值时酶的结构柔性较大，酶的构象趋于向疏水环境中热力学稳定的状态变化，导致酶结构改变和失活。只有在最佳含水量时蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间达到最佳平衡点，酶才表现出最大活力。有机溶剂对酶催化反应的影响有机溶剂对酶催化反应的影响o影响途径有3种：o1. 有机溶剂直接与酶作用，通过破坏酶蛋白活性构象的氢键、疏水作用等，改变酶的构象，从而抑制酶活或导致酶失活；o2. 影响酶反应过程中的底物和产物的扩散，从而间接影响酶活性，改变反应平衡点，可进行在线分离，分出产物或不需要的副产物，使平衡朝所期望的方向移动。本章目录o3. 直接与酶分子周围的水相互作用。o因而在微水体系中，强极性有机溶剂往往对酶的催化活性不利，因为会夺取酶表面的必需水，破坏酶构象。o所以选择有机溶剂应有一定的疏水性。如酶在丁醇和十六烷活性不同，后者更稳定。o有机溶剂极性的强弱可用疏水参数lgP表示。oP值指溶剂在正辛烷和水两相中的分配系数。疏水参数越大，表明其疏水性越强。o有机溶剂的选择o选择要适当。极性过强(lgP5)的溶剂，对必需水夺取少，疏水性底物溶解度也高，但底物难于进入酶分子的必须水层，催化反应速度也不高。o选用2lgP5的溶剂作为催化反应介质。o水有机溶剂有甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙腈等o水不溶性有机溶剂：石油醚、乙醚、戊醚、辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，已酯，二氯甲烷等。酶的种类和浓度o酶种类：依据反应的类型，如：脂肪酶、蛋白酶、氧化酶等o酶形式的选择：冷冻干燥的酶粉、固定化酶、结晶酶、酶与大分子物质的复合物等o使用载体对酶固定化，所选择载体对酶的微水环境影响尽可能小。如果酶基本存在于载体表面，则疏水性载体对酶的固定化有利。o随着载体亲水性增强，酶的催化活力呈下降趋势 (亲水基团争夺必需水，导致构想改变)。提高载体疏水基团含量，可提高固定化酶对疏水性底物的亲和力，提高反应活性。底物的种类和浓度o依据酶在所使用有机介质中的专一性选择适宜的底物o底物浓度-酶促反应速度温度o在微水有机介质中，酶促反应的最适温度高于水溶液中的最适温度o温度升高，立体选择性下降pHopH记忆o有机相中最适pH通常与水溶液中相同或接近o酶分子从缓冲液中转到有机介质后，酶分子保留原有的pH印记o通过调节缓冲液pH，对有机介质中酶催化的pH值进行调节离子强度o有机介质中，酶的催化活性与酶在缓冲液中的离子强度和pH有密切关系o盐，增加离子强度，可帮助酶维持构象。o可通过调节缓冲液中离子强度的方法对有机介质中酶催化的离子强度进行调节控制。6.5 6.5 酶非水相催化的应用酶非水相催化的应用 酶 催化反应 应用 脂肪脂肪酶酶 肽合成 青霉素G前体肽合成 酯合成 醇与有机酸合成酯类 转酯 各种酯类生产 聚合 二酯的选择性聚合 酰基化 甘醇的酰基化蛋白酶 肽合成 合成多肽 酰基化 糖类酰基化羟基化酶 氧化 甾体转化过氧化物酶 聚合 酚类、胺类化合物的聚合多酚氧化多酚氧化酶酶 氧化 芳香化合物的羟基化 胆固醇氧化酶 氧化 胆固醇测定醇脱氢酶 酯化 有机硅醇的酯化手性药物的拆分o手性化合物：化学组成相同，立体结构互为对映体的两种异构体化合物。o一种显著疗效，一种弱或无效；o一种显著疗效，一种毒副作用；o两者药效相反；或具有不同的药效；或具有互补性手性手性药药物两种物两种对对映体的映体的药药理作用理作用 药物名称有效对映体的作用另一种对映体的作用普萘洛尔（Propranolol）萘普生（Neproxen）青霉素胺（Penicillamine）羟基苯哌嗪(Dropropizine)反应停（Thalidomide）酮基布洛芬（Ketoprofen）喘速宁（Trtoquinol）乙胺丁醇（Ethambutol）萘必洛尔（Kebivolol）S构型，治疗心脏病,-受体阻断剂S构型，消炎、解热、镇痛S构型，抗关节炎S构型，镇咳S构型，镇静剂S构型，消炎S构型，扩张支气管S,S构型，抗结核病右旋体，治疗高血压,-受体阻断剂R构型，钠通道阻滞剂R构型，疗效很弱R构型，突变剂R构型，有神经毒性R构型，致畸胎R构型，防治牙周病R构型，抑制血小板凝集R,R构型，致失明左旋体，舒张血管1992年，美国FDA明确要求对于具有手性特性的化学药物，都必需说明其两个对映两个对映体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况。许多国家和地区也都制定了有关手性药物的政策和法规。这大大推动了手性药物拆分的研究和生产应用。目前提出注册申请和正在开发的手性药物中，单一对映体药物占绝大多数。 o手性药物的合成与生产中，除通过不对称合成的方法得到光学纯的手性化合物外，一般得到的由等量的对应异构体分子组成的外消旋体。o非生物法拆分：利用机械分离法、色谱分离法、动力学拆分等o生物法：2个对映体竞争的酶同一活性中性位置，两者反应速度不同，产生选择性而分开脂肪酶脂肪酶- -位置选择性酯化反应位置选择性酯化反应葡萄糖苷-6-O-酰基衍生物是一种可生物降解的非离子表面活性剂，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下进行选择性酯化得到：糖酯的合成糖酯的合成脂肪酶脂肪酶- -消旋化合物选择性酯化消旋化合物选择性酯化以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸为原料，在有机溶剂介质中用脂肪酶(CCL)或猪肝酯酶（PLE）催化酯化反应，可得到较高光学纯度的R-或S-酯。脂肪酶脂肪酶- -消旋化合物的拆分消旋化合物的拆分有机介质中用脂肪酶(PSL)催化酯化用于-羟基-,-不饱和酯的拆分。可以避免副反应的发生。脂肪酶脂肪酶- -内酯合成反应内酯合成反应-羟基酸或它的酯在脂肪酶催化下，发生分子内环化作用得到内酯化合物。内酯可继续反应形成开链寡聚物.内酯化产物形式主要取决于羟基酸的长度外，也取决于脂肪酶的类型、溶剂及温度等。生物柴油生物柴油生物柴油是利用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生生物柴油是利用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。 生物油脂的来源：菜子油，豆油，椰子油，棕榈油、蓖麻油、棉籽油，葵花籽 油，废食用油等优点：优点：（1） 具有良好的环境属性（2） 具有较好的低温发动机启动性能。（3） 具有较好的润滑性能。（4） 具有较好的安全性能。（5） 具有良好的燃料性能。（6） 具有可再生性能。从生物质到生物柴油生物柴油生产装备美国生物柴油发展趋势美国生物柴油发展趋势生物柴油的生产方法生物柴油的生产方法o目前生物柴油主要是用化学法生产，采用酸、碱催化油脂与甲醇之采用酸、碱催化油脂与甲醇之间的转酯反应，而生成脂肪酸甲酯间的转酯反应，而生成脂肪酸甲酯。反应时间短，成本低。但在反应过程中使用过量的甲醇，而使后处理过程变得较为繁杂。能耗高；色泽深，在高温下容易变质；酯化产物难于回收；生产过程有废碱液排放o新方法：生物酶法，生物酶法，在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与小分子在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与小分子醇类的酯交换反应，生成小分子的酯类混合物醇类的酯交换反应，生成小分子的酯类混合物。条件温和，醇用量小、无污染排放。缺点：对甲醇及乙醇的转化率低，一般仅为40%60%，酶的使用寿命短。副产物甘油和水难于回收，不但对产物形成抑制，而且甘油对固定化酶有毒性，使固定化酶使用寿命短。本章目录o思考题o有机介质酶催化的优点o有机介质的反应体系有哪几种？o水和有机溶剂对有机介质中酶催化的影响o酶在有机介质中的催化特性?