氯化胆碱氯化胆碱李树友李树友北京绿安祥生物技术有限公司北京绿安祥生物技术有限公司一、胆碱知识概述一、胆碱知识概述二、胆碱、甜菜碱、蛋氨酸的关系二、胆碱、甜菜碱、蛋氨酸的关系三、胆碱缺乏症三、胆碱缺乏症四、三甲胺的危害四、三甲胺的危害五、氯化胆碱的质量现状五、氯化胆碱的质量现状六、汉威氯化胆碱的特点六、汉威氯化胆碱的特点一、胆碱知识概述一、胆碱知识概述-理化特性理化特性l氯化胆碱氯化胆碱Cholini ChloridumCholini Chloridum又名为氯化又名为氯化胆脂，三甲基胆脂，三甲基(2-(2-羟乙基羟乙基) )铵氯化物。固态氯化铵氯化物。固态氯化胆碱为白色结晶，液态为淡黄色（通常称为胆胆碱为白色结晶，液态为淡黄色（通常称为胆碱油或水剂），稍有特殊异味，分子式碱油或水剂），稍有特殊异味，分子式C C5 5H H1414ClNOClNO，分子量。属，分子量。属B B族维生素，族维生素，9090以上用以上用作饲料添加剂作饲料添加剂; ;l水剂可与乙醇混合，几乎不用于醚和苯，有吸水剂可与乙醇混合，几乎不用于醚和苯，有吸湿性，吸收二氧化碳后发出胺的臭味。湿性，吸收二氧化碳后发出胺的臭味。 一、胆碱知识概述-生理功能l胆碱首次于1849年由牛的胆汁中分离到。人们自1939年以来认识到了胆碱在营养上的重要作用，现在已成了人类食品和动物饲料中常用的添加剂。美国的联邦法典将胆碱列为“一般认为安全”（generally recognized as safe）的产品。欧洲联盟根据1991年颁布的法规将胆碱列为允许添加于婴儿食品的产品。l胆碱具有甜菜碱和蛋氨酸无法取代的基本代谢功能和可取代的非必需代谢功能一、胆碱知识概述-生理功能l基本代谢功能：l作为磷脂的组成成分，是构筑和维持细胞结构所必需的，同时也是软骨基质正常成熟所必需的；l是副交感神经递质乙酰胆碱的合成前体，如对消化道、输卵管的收缩的制约；l是肝脏脂肪代谢所必需的，促进肝脏脂肪以脂蛋白（甘油三酯和胆固醇、磷脂、蛋白的复合物）形式输送、脂肪酸的氧化，防止脂肪在肝脏中反常积聚；l非必需代谢功能l提供活性甲基，合成激素、核酸、蛋氨酸、肉碱（促进肝脏中的脂肪氧化利用）等。这种功能可与Met、甜菜碱协同。二、胆碱、甜菜碱和蛋氨酸间的关系二、胆碱、甜菜碱和蛋氨酸间的关系1化学结构式不同 NH2 CH3-S-CH2-CH-COOH 蛋氨酸 CH3CH3-N+Cl-CH2-CH2-OH CH3 氯化胆碱 CH3CH3-N-CH2-COOH CH3 甜菜碱二、胆碱、甜菜碱和蛋氨酸间的关系二、胆碱、甜菜碱和蛋氨酸间的关系2蛋氨酸蛋白质合成细胞膜结构胆 碱胱氨酸合成乙酰胆碱合成甲基供体脂肪代谢甜菜碱二、胆碱、甜菜碱和蛋氨酸间的关系二、胆碱、甜菜碱和蛋氨酸间的关系3氨基乙醇胆碱S-腺苷蛋氨酸甘氨酸蛋氨酸S-腺苷高半胱氨酸N5、N10-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甜菜碱醛甜菜碱甲基甘氨酸二甲基甘氨酸-CH3+四氢叶酸VB12-CH3-CH3-CH3甲基携带转运过程l蛋氨酸：生物学功能:(1)合成蛋白质;(2)转化为胱氨酸,提供硫元素;(3)提供甲基；(4)脂肪代谢。在动物体内有百种以上的甲基化过程都需要蛋氨酸参与。l甜菜碱：属维生素类似物，无强吸湿性、无毒、稳定、耐高温（200）具有双电荷性质和活性甲基，不破坏维生素的稳定性。其生物学功能：1、提供活性甲基；2、渗透压保护物质，减轻代谢应激；3、诱食作用；水产养殖方面。4、脂肪代谢，促进脂肪动员、脂肪酸氧化。在动物体内，它是胆碱经二次氧化作用的产物，是胆碱参与甲基代谢的中介。所以，这一过程只是循环传递甲基的过程，而不是蛋氨酸的合成途径。 胆碱、甜菜碱和蛋氨酸分子中都含有甲基。甜菜碱是直接、有效的甲基供体；叶酸是甲基载体，维生素B12则与一碳单位（甲酸、丝氨酸或甘氨酸）形成甲基有关；甲基供体都与脂肪代谢有密切联系；在满足各自特有生理功能的基础上，就供甲基而言，胆碱、甜菜碱和蛋氨酸可以互相替代。按甲基含量计算，1kg97%的甜菜碱相当2.3kg50%的氯化胆碱；相当于3.75kg99%的蛋氨酸。但沈同(1980)的报道表明,某些生化反应需要不同的甲基源。 1、甜菜碱替代胆碱没有实际意义，因为甜菜碱的价格较胆碱昂贵；必须保证胆碱满足总需要量的75%，其余部分可以替代； 2、日粮蛋氨酸不足，胆碱的添加效果明显。 3、甜菜碱的生物学利用率目前还没有确定。对于玉米豆粕型日粮，甜菜碱替代蛋氨酸应在下述前提下进行：(1)基础日粮中蛋氨酸满足需要的88%或总含硫氨基酸满足需要的90%以上；(2)甜菜碱只能替代蛋氨酸总需要量的20%25%，或总含硫氨基酸的15%，以2:1(蛋氨酸:甜菜碱)比例替代为好；(3)杂粕型日粮替代比例应降低；(4)应激情况下添加甜菜碱有一定效果。结论三、胆碱的缺乏症三、胆碱的缺乏症大多数的动物都具有合成胆碱的能力，但这种能力受到动物体内与胆碱合成和分解有关的酶的活性的影响，并且受到饲料中蛋氨酸、甜菜碱、VB12 等因素的影响。饲料原料中尽管存在天然胆碱，但其含量可因栽培条件的不同而不同,比如气候、品种、土壤、地域、肥料、灌溉等。若干饲料原料中氯化胆碱含量分析值同表格值的比较原 料NRC(1994)表格值(ppm)IEEB(1997)胆碱含量换算为氯化胆碱分析值(ppm)玉米620713200豆粕(48%)273131403560玉米面筋粉330379660油脂肉粉207723881570小麦10021152440化学测定值并不能显示天然胆碱的生物利用率，豆粕、油菜籽和花生粕中天然胆碱的生物利用率为83%、24%和70%，这些数值虽然表明了不同原料中天然胆碱的生物利用率有很大的不同，同时也表明了按表格数据配合日粮的做法中存在的问题。油菜籽中胆碱含量(6198ppm)高于豆粕和花生粕（分别为2218和1685ppm)，但其利用率尚不及另二者的三分之一。一项研究证实了天然胆碱利用率的不确性，该研究中对雏鸡饲喂按化学分析值胆碱明显充足的日粮,但结果雏鸡生长仍因添加胆碱而表现显著改善。动物种类动物种类缺乏症状缺乏症状家禽家禽减缓生长，产蛋率降低、蛋小。种蛋可孵化率减缓生长，产蛋率降低、蛋小。种蛋可孵化率降低，再肝和肾中积累脂肪，脱腱症，行为紊降低，再肝和肾中积累脂肪，脱腱症，行为紊乱，肌肉营养不良乱，肌肉营养不良猪猪增长缓慢，肢体外张，运动失调、呈犬做姿势增长缓慢，肢体外张，运动失调、呈犬做姿势被毛粗乱，繁殖力差，脂肪肝，肌肉营养不良被毛粗乱，繁殖力差，脂肪肝，肌肉营养不良牛牛呼吸障碍，行为紊乱，无食欲，生长减慢呼吸障碍，行为紊乱，无食欲，生长减慢鱼鱼增长减缓，脂肪肝，饲料效率差，肾及肠出血增长减缓，脂肪肝，饲料效率差，肾及肠出血猫、狗、毛猫、狗、毛皮动物皮动物行为紊乱，脂肪肝，毛色变差行为紊乱，脂肪肝，毛色变差几种常见动物胆碱缺乏症几种常见动物胆碱缺乏症 一般生长猪对添加胆碱无响应，怀孕母猪和高产奶牛需要添加胆碱； 家禽日粮中，尤其幼禽日粮种必 须添加胆碱； 水产动物日粮中必须添加胆碱。在饲料中必须要添加胆碱！胆碱是动物体内不可缺少的营养物质，虽然大部分动物可以自身合成，但常不能满足自身需要，尤其是幼龄动物，因此，应注意外源补加。 氯化胆碱是以三甲胺，环氧乙烷、盐酸为原料，在一定条件下反应生成。最后以玉米芯粉为载体制得粉剂，粒度介于20一80目之间，是饲料中胆碱添加的产品形式。氯化胆碱氯化胆碱的稳定性和效价l稳定性l粉剂或水剂在饲料中均很稳定，但对VA、VD3、VE、VK等均具有破坏作用，宜单独添加。l效价l氯化胆碱的相对活性相当于胆碱的87%，故75%的氯化胆碱水剂效价为其65.25%，50%粉剂为其43.5%。一般在高能饲料或饲料中蛋氨酸、VB12及叶酸不足时，应增加供给量四、关于三甲胺l三甲胺是工业合成氯化胆碱的原料之一；l三甲胺的危害：1、刺激、破坏机体器官的粘膜，引起过敏反应；2、破坏肝脏中凝血酶原，动物出现出血的病症； 3、易吸湿、氧化，产生腥臭味，抑制采食，使畜产品质量降低；4、抑制蛋白质和DNA的合成。五、氯化胆碱的质量现状五、氯化胆碱的质量现状饲料级氯化胆碱国家标准的技术要求饲料级氯化胆碱国家标准的技术要求 项项 目目 粉剂指标粉剂指标 50 506060氯化胆碱含量氯化胆碱含量% % 50.0 50.060.060.0（三甲胺含量）（三甲胺含量） 总游离氨总游离氨/ /胺含量胺含量% % (0.10) (0.10)(0.10)(0.10)(0.10)(0.10)(0.10)(0.10)重金属重金属( (以以pbpb计计)% )% 0.0020.0020.0020.002干燥减重干燥减重% % 4.0 4.0 4.0 4.0细度细度, ,过筛率过筛率% % 90 90 90 90氯化胆碱主要质量问题氯化胆碱主要质量问题l氯化胆碱含量不足氯化胆碱含量不足l三甲胺含量超标三甲胺含量超标l产品其他性能如水剂颜色过深、粉剂结块、产品其他性能如水剂颜色过深、粉剂结块、流动性不好或比重不够；流动性不好或比重不够；l重金属超标重金属超标l二噁英问题二噁英问题掺假行为向原国标检测方法掺假行为向原国标检测方法 提出挑战提出挑战lHG 2941-1999HG 2941-1999质量要求质量要求粉剂：粉剂：3 3项项l含量测定方法含量测定方法 高氯酸非水滴定法高氯酸非水滴定法 银量法银量法 基于氯化胆碱中的基于氯化胆碱中的ClCl- -，并非基于氯化胆碱的特，并非基于氯化胆碱的特异结构和理化性质，许多廉价无机氯化物和有盐酸异结构和理化性质，许多廉价无机氯化物和有盐酸盐，如盐，如NaClNaCl、NHNH4 4ClCl、三甲胺盐酸盐等均可参与、三甲胺盐酸盐等均可参与、干扰测定。目前掺假现象泛滥的一个重要原因就是干扰测定。目前掺假现象泛滥的一个重要原因就是利用了现行标准的这一先天缺陷。利用了现行标准的这一先天缺陷。l1998年以来，中国市场饲料级氯化胆碱的掺假问题十分突出，使许多用户和正规氯化胆碱生产厂家蒙受损失，而且影响到周边国家乃至其他地区的产品进出口贸易。因此，氯化胆碱的质量监测方法与质量状况也成了人们的关注热点。l随着2004年氯化胆碱生产原料的涨价，生产厂经济压力大，且氯化胆碱含量测定方法修订标准未能及时出台，掺假行为又有所反弹，据一些检测实验室的不完全统计,买卖双方送检发现的不合格和掺假品约达33%45%。 l主要造假手段在粉剂产品中加无机盐，特别是NaCl、kCl、NH4Cl、CaCl2、硝酸铵、碳酸铵等加三甲胺加乌洛托品（即六次甲基四胺，为季胺盐，不能被碱分解） 掺假手法掺假手法一套行之有效的监测方法一套行之有效的监测方法l为了有效地识别和防范各种掺杂使假的氯化胆为了有效地识别和防范各种掺杂使假的氯化胆碱，现向大家简单介绍几种鉴别方法：碱，现向大家简单介绍几种鉴别方法：l表观识别表观识别 l定性试验定性试验是否搀有乌洛托品和三甲胺是否搀有乌洛托品和三甲胺l选择正确的方法进行定量测定选择正确的方法进行定量测定l结果判断结果判断表观识别表观识别 粉剂产品由于载体不同粉剂产品由于载体不同, , 外观不同，主要观察外观不同，主要观察颜色、气味以及看它是否均匀一致，颜色、气味以及看它是否均匀一致， - - 植物玉米芯、稻壳粉等土黄至棕黄均匀粉末植物玉米芯、稻壳粉等土黄至棕黄均匀粉末，不应有，不应有“白霜白霜”状物、晶状白粉，摇动后底状物、晶状白粉，摇动后底部不应出现部不应出现“白粉白粉” - - 正常粉剂略有鱼腥气味，但很淡；正常粉剂略有鱼腥气味，但很淡； - - 放置半小时放置半小时, , 有吸潮现象；有吸潮现象； - - 加热是否变黑加热是否变黑搀有乌洛托品和三甲胺的定性检测搀有乌洛托品和三甲胺的定性检测 对对于于粉粉剂剂氯氯化化胆胆碱碱样样品品3-5g, 3-5g, 加加热热水水( (约约60-60-70)50mL,70)50mL, 振振摇摇提提取取, , 过过滤滤, , 取取约约20-30mL20-30mL滤滤液液。对对于于水水剂剂样样品品则则直直接接取取1-2g1-2g，加加水水稀稀释释。在在滤滤液液或或稀稀释释液液中中，加加浓浓硫硫酸酸1mL,1mL,置置电电炉炉上上加加热热、煮煮沸沸, , 用用沾沾有有氨氨制制硝硝酸酸银银溶溶液液或或纳纳氏氏试试剂剂的的试试纸纸检检验验，如如产产生生的的蒸蒸汽汽使使滤滤纸纸变变黑黑，说说明明有有甲甲醛醛产产生生。令令该该溶溶液液冷冷却却，加加入入过过量量的的氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液( (约约5mL)5mL)，煮煮沸沸，用用石石蕊蕊试试纸纸或或pHpH试试纸纸检检验验看看是是否否有有氨氨气气放放出出, , 如如试试纸纸变变兰兰, , 证证明明有有氨氨气气放放出出。如如产产品品加加酸酸煮煮沸沸后后有有甲甲醛醛形形成成，说说明明有有乌乌洛洛托托品品存存在在。如如加加碱碱煮煮沸沸后后有有氨氨气气产生，说明产品中可能有乌洛托品或三甲胺存在。产生，说明产品中可能有乌洛托品或三甲胺存在。 不同检测方法的比较不同检测方法的比较 l对对各各级级有有机机胺胺（包包括括氨氨基基酸酸）和和无无机机含含氯氯化化合合物物均均有有反反应应，因因此此对对NaClNaCl、KClKCl、NHNH4 4ClCl、三三甲甲胺胺等等均均不不能识别。能识别。l有有些些产产品品烘烘干干后后，滴滴定定终终点点不不清清晰晰。粉粉剂剂需需用用甲甲醇醇提取，并蒸干，价格高，有污染。提取，并蒸干，价格高，有污染。l对对无无机机氯氯化化物物和和离离子子态态有有机机物物盐盐酸酸盐盐均均有有反反应应，尤尤其能将生产中遗留的其能将生产中遗留的ClCl- - 也会换算成氯化胆碱。也会换算成氯化胆碱。l同非水滴定法，须有机溶剂提取和蒸干。同非水滴定法，须有机溶剂提取和蒸干。l测测定定结结果果偏偏高高，并并易易受受产产品品中中的的氯氯离离子子干干扰扰，故故原原标准规定使用时须校正。标准规定使用时须校正。非水滴定法非水滴定法银银 量量 法法四苯硼钠法四苯硼钠法雷氏盐重量法雷氏盐重量法定定 氮氮 法法不能分辨有机含氮化合物（直接碱蒸馏和消解不能分辨有机含氮化合物（直接碱蒸馏和消解+ +蒸馏）蒸馏） 四苯硼钠是测钾的经典试剂，因此在氯化胆碱测定四苯硼钠是测钾的经典试剂，因此在氯化胆碱测定中起码不能排除含钾无机盐的干扰。中起码不能排除含钾无机盐的干扰。 雷氏盐试剂能与胺反应，但通过沉淀前的碱煮过程，雷氏盐试剂能与胺反应，但通过沉淀前的碱煮过程，将一、二和三级胺破坏，其他可能的干扰物还有氨基酸、将一、二和三级胺破坏，其他可能的干扰物还有氨基酸、四级胺和汞，经酸煮可识别乌洛托品的存在。四级胺和汞，经酸煮可识别乌洛托品的存在。离子色譜法离子色譜法LC-MS法法 通通过过离离子子交交换换机机理理将将带带有有不不同同电电荷荷、离离子子半半径径和和结结构构等等有有差差异异的的离离子子分分离离，所所以以和和其其他他色色谱谱法法一一样样，虽虽不不排排除除有有不不同同化化合合物物与与氯氯化化胆胆碱碱有有同同样样或或相相近近的的保保留留时时间间，但但在在规规定定的的实实验验条条件件下下，可可能性极小。能性极小。 质谱可将各种有一定极性的化合物通过大气压电质谱可将各种有一定极性的化合物通过大气压电离，形成与其化学结构直接相关的准分子离子和离子离，形成与其化学结构直接相关的准分子离子和离子碎片，根据总离子流图中这些离子或离子碎片的存在，碎片，根据总离子流图中这些离子或离子碎片的存在，可准确定性，并根据准分子离子峰面积和外标法在不可准确定性，并根据准分子离子峰面积和外标法在不必完全分离的情况下定量。必完全分离的情况下定量。 特异性好，识假能力强，能作为确证方法，定性特异性好，识假能力强，能作为确证方法，定性准确性最高，也能同时定量。准确性最高，也能同时定量。测定方法测定方法1-雷氏盐重量法雷氏盐重量法l粉剂：称取经粉剂：称取经105105干燥至衡重的试样干燥至衡重的试样1g1g（精确（精确0.0002 g0.0002 g）置于）置于100mL100mL容量瓶中容量瓶中+ +水水70mL7070mL70水浴中加热水浴中加热15min15min震荡震荡10min10min用水定容用水定容过过滤滤吸取至吸取至150mL150mL高脚烧杯中高脚烧杯中+40%+40%的的NaOHNaOH溶液溶液3mL,3mL,摇匀摇匀, ,盖一倒置的漏斗盖一倒置的漏斗电炉上加热电炉上加热, ,并煮并煮沸沸5min5min冷却、加酸调节溶液冷却、加酸调节溶液pH5-6pH5-6移入冰水移入冰水浴冷却至浴冷却至55以下以下+2%+2%雷氏盐甲醇溶液雷氏盐甲醇溶液15mL15mL不不时搅拌时搅拌, ,反应反应30min30min静置陈化静置陈化1h1h将沉淀定量将沉淀定量转移到已在转移到已在105105烘至衡重并称量过的烘至衡重并称量过的G4G4砂芯漏砂芯漏斗中斗中减压抽滤减压抽滤用水洗涤烧杯和沉淀用水洗涤烧杯和沉淀3434次次105105烘干烘干2h2h，称重。，称重。l水剂：直接称取水剂：直接称取1g1g样品，用水定容至样品，用水定容至100mL100mL，以，以下测定步骤同粉剂。下测定步骤同粉剂。测定方法测定方法2离子色谱法离子色谱法l样品前处理：样品前处理： 粉剂的提取与水剂稀释同雷氏盐重量法，只是粉剂的提取与水剂稀释同雷氏盐重量法，只是仪器测定前需进一步稀释约仪器测定前需进一步稀释约100100倍。倍。l色谱条件：色谱条件： 色谱柱：色谱柱：4mm*250mm4mm*250mm，装有羧基，装有羧基/ /磷酸基弱酸阳磷酸基弱酸阳离子交换树脂，粒径离子交换树脂，粒径 柱温：柱温：3030 流动相：流动相：2 2SOSO4 4水溶液水溶液 流速：流速：1mL/min1mL/min 检测器：具抑制器的电导检测器检测器：具抑制器的电导检测器定定 氮氮 法法l一般必须起码做两个测定一般必须起码做两个测定l水提取液消解水提取液消解+ +碱蒸馏碱蒸馏 测定总测定总N N即有机含氮即有机含氮化合物之和（蛋白、氨基酸、氨态氮、胆碱）化合物之和（蛋白、氨基酸、氨态氮、胆碱）正常情况反映三甲胺和氯化胆碱之和正常情况反映三甲胺和氯化胆碱之和l直接直接 碱蒸馏碱蒸馏 测定氨态氮和一、二三级胺测定氨态氮和一、二三级胺（正常情况反映三甲胺的量）（正常情况反映三甲胺的量）结果的判断结果的判断依据产品标准或有关合同：依据产品标准或有关合同： a. a. 凡是标明凡是标明x%x%，测定方法误差应由生产厂家考虑；测定方法误差应由生产厂家考虑； b. b. 凡只表明凡只表明x%x%，合同中应说明测定方法合同中应说明测定方法, , 方法误差一方法误差一般为方法允许差的两倍计。般为方法允许差的两倍计。不同的方法误差大小不同：不同的方法误差大小不同： 允许差允许差 b.b.的数值范围的数值范围 高氯酸非水滴定和银量法高氯酸非水滴定和银量法 0.2% X0.4%0.2% X0.4% 雷氏盐重量法和离子色谱法雷氏盐重量法和离子色谱法 0.7% 98%X0.7% 98%X 合同保护合同保护时间时间: :合同约定在实际买卖活动之前合同约定在实际买卖活动之前内容内容: :应有氯化胆碱含量要求应有氯化胆碱含量要求 还应有测定方法还应有测定方法 规定样品与实际进货的质量一致性规定样品与实际进货的质量一致性 对于含量不足与其他质量问题的处置定对于含量不足与其他质量问题的处置定稳定的供货关系与质控曲线的建立稳定的供货关系与质控曲线的建立六、汉威氯化胆碱的特点六、汉威氯化胆碱的特点项项目目国国标产标产品品阿克阿克苏诺贝苏诺贝尔尔汉汉威威产产品品表观密度一般573g/cm3480g/cm3均匀度一般优，均匀吸附优，均匀吸附流动性一般好，无结块好，无结块干物质96%98% (0.5-1%)98% (99.9%)氯化胆碱量50%（干基） 50%50%（湿基）三甲（TMA）1000ppm300500ppm100ppm其它无二噁英、低重金属、低黄曲霉毒素