诺如病毒研讨进展及一同邮轮诺如病毒感染疫情的实验室检测上海国际游览卫生保健中心实验室上海国际游览卫生保健中心实验室 章琪章琪 方筠方筠 王家栋王家栋 :021-62688086 :021-62688086 : zhangqshciq.gov : zhangqshciq.gov食源性急性胃肠炎综述诺如病毒引见案例引见一同邮轮诺如病毒感染疫情的实验室检测第一部分：食源性急性胃肠炎综述食源性急性胃肠炎流行现状 Source: Foodborne Outbreak Reporting System cdc.gov/foodborneoutbreaks/主要病原体：主要病原体：毒素介导毒素介导Toxin-mediated): Toxin-mediated): 水样便水样便 病毒：诺如，轮状，星状，腺病毒病毒：诺如，轮状，星状，腺病毒 细菌：细菌： 蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌 ，产气荚膜梭菌，金黄色葡萄球菌，产气荚膜梭菌，金黄色葡萄球菌 ，产肠，产肠毒素毒素 型大肠杆菌型大肠杆菌侵袭性病原体侵袭性病原体Invasive microbes) :Invasive microbes) :脓血便脓血便 细菌：大肠杆菌侵袭性、致病性、出血性，沙门氏菌，空肠细菌：大肠杆菌侵袭性、致病性、出血性，沙门氏菌，空肠弯曲弯曲 杆菌，志贺氏菌，困难梭菌杆菌，志贺氏菌，困难梭菌 原虫：贾第鞭毛虫，溶组织内阿米巴原虫：贾第鞭毛虫，溶组织内阿米巴浸透性病原体浸透性病原体Penetrating microbes): Penetrating microbes): 系统感染系统感染 细菌：伤寒、副伤寒沙门氏菌，鼠疫杆菌细菌：伤寒、副伤寒沙门氏菌，鼠疫杆菌感染途径：感染途径：uu病人接触：诺如病毒、志贺氏菌、出血性大肠杆菌病人接触：诺如病毒、志贺氏菌、出血性大肠杆菌uu游览：大肠杆菌、沙门氏菌、贾第鞭毛虫游览：大肠杆菌、沙门氏菌、贾第鞭毛虫uu 邮轮：诺如病毒邮轮：诺如病毒Cruise-ship virusCruise-ship virusuu动物接触：沙门氏菌，出血性大肠杆菌，贾第鞭毛虫动物接触：沙门氏菌，出血性大肠杆菌，贾第鞭毛虫uu疫水：隐孢子虫，出血性大肠杆菌疫水：隐孢子虫，出血性大肠杆菌uu污染的食物：沙门氏菌污染的食物：沙门氏菌致病性：致病性：感染感染剂剂量：病原体量：病原体颗颗粒数粒数隐孢隐孢子虫：子虫：10-10010-100志志贺贺氏菌：氏菌：10-10010-100出血性大出血性大肠肠杆菌：杆菌：10-10010-100空空肠肠弯曲杆菌：弯曲杆菌：104106104106沙沙门门氏菌：氏菌：105108105108霍乱弧菌：霍乱弧菌：105108105108产肠产肠毒素型大毒素型大肠肠杆菌：杆菌：108108鼠疫杆菌：鼠疫杆菌：109109Slutsker L, et al. Ann Intern Med 2019; 126:505-13食源性急性胃食源性急性胃肠炎的防控依然是炎的防控依然是很大的挑很大的挑战！诺诺如病毒：如病毒：如病毒：如病毒：10-10010-100第二部分：诺如病毒引见历史：In 1929, Zahorsky proposed the name “winter vomiting diseaseIn 1929, Zahorsky proposed the name “winter vomiting disease to to describes outbreaks of presumed viral gastroenteritis describes outbreaks of presumed viral gastroenteritis In the 1940s, Gordon demonstrated that pooled stool filtrates In the 1940s, Gordon demonstrated that pooled stool filtrates obtained from patients in an institutional outbreak of nonbacterial obtained from patients in an institutional outbreak of nonbacterial gastroenteritis could infect inoculated volunteers gastroenteritis could infect inoculated volunteersIn 1968, CDC investigated an outbreak of vomiting disease in anIn 1968, CDC investigated an outbreak of vomiting disease in an elementary school in Norwalk OH: 50% of students and teachers elementary school in Norwalk OH: 50% of students and teachers developed gastroenteritis developed gastroenteritisKaplan used immune electronmicroscopy to identify viral particlesKaplan used immune electronmicroscopy to identify viral particles in the stools of volunteers infected with the “Norwalk in the stools of volunteers infected with the “Norwalk strain strainVirus initially classified as small round viruses, later reclassified asVirus initially classified as small round viruses, later reclassified as caliciviruses when genome cloned caliciviruses when genome cloned Dr. Albert Kapikian 1972, electron microscopy Small Round-Structured Virus (SRSV) 27 nmKapikian AZ, et al. Visualization by immune electron microscopy of a 27-nm particle associated with acute infectious nonbacterial gastroenteritis. J Virol, 1972, 10 (5): 1075-1081. 美国美国20192019年诺如病毒引起的急性胃肠炎数量年诺如病毒引起的急性胃肠炎数量发生场所发生场所发生场所发生场所疫情数量疫情数量疫情数量疫情数量邮轮邮轮 37 37养老院养老院 37 37餐馆餐馆 13 13医院医院 7 7学校学校 3 3聚会聚会 3 3其它其它 26 26总计总计总计总计 126126流行现状：流行现状： 自自20192019年我国年我国报报道首例道首例诺诺如病毒感染以来，近年来在我国已有多起如病毒感染以来，近年来在我国已有多起诺诺如病毒引起的急性胃如病毒引起的急性胃肠肠炎迸炎迸发发疫情的疫情的报报道道 ： 韩韩安康，沈建勇，姚文庭，等安康，沈建勇，姚文庭，等. .一同一同诺诺如病毒如病毒 型型 型混合感染急性胃型混合感染急性胃肠肠炎迸炎迸发发疫情疫情调查调查分析分析. .中中华实验华实验和和临临床病毒学床病毒学杂杂志，志，2019,22(4): 263-2652019,22(4): 263-265程慧健，袁程慧健，袁辉辉，熊英，等，熊英，等. .一同一同诺诺如病毒感染性腹泻迸如病毒感染性腹泻迸发发的的调查调查. .中中华华流行病流行病学学杂杂志志,2019,29(6):627-628,2019,29(6):627-628钟钟培松，王韶培松，王韶华华，陈时陈时千，等千，等. . 一同福利院一同福利院诺诺瓦克病毒胃瓦克病毒胃肠肠炎迸炎迸发调查发调查. .中国中国预预防医学防医学杂杂志，志，20192019，8(5):621-6238(5):621-623林玫，刘巍，梁大斌，等林玫，刘巍，梁大斌，等. . 诺诺如病毒引起的感染性腹泻迸如病毒引起的感染性腹泻迸发发疫情疫情调查调查. .运用运用预预防医学防医学,2019,13(1):11-14 ,2019,13(1):11-14 我国流行现状我国流行现状 2019 2019年和年和20192019年分年分别别在北京和太原开展的人群血清在北京和太原开展的人群血清标标本中的本中的诺诺瓦克瓦克样样病毒特异性病毒特异性IgGIgG抗体抗体检测阐检测阐明，北京市明，北京市诺诺瓦克瓦克样样病毒抗体病毒抗体总检总检出率出率为为88.888.8以上。太原市以上。太原市总检总检出率出率在在78.678.6以上。以上。 2019-2019 2019-2019在福州地域用在福州地域用RT-PCRRT-PCR方法方法对对288288份腹泻患份腹泻患者者粪粪便便标标本本诺诺瓦克瓦克样样病毒病原病毒病原检测显检测显示，示，诺诺瓦克瓦克样样病毒基病毒基因因组组I I的阳性率的阳性率为为11.111.1，主要是，主要是7 7岁岁以上儿童及成人；以上儿童及成人；诺诺瓦克瓦克样样病毒基因病毒基因组组的阳性率的阳性率为为 28.8 28.8，主要是，主要是6 6月月龄龄至至3 3岁婴岁婴幼儿。幼儿。 我国流行现状我国流行现状根本特征：uu发发病率高、致病病率高、致病剂剂量低、抵抗力量低、抵抗力强强，被，被WHOWHO定定为为B B类类病原体；病原体；uu对对加加热热、低温具有、低温具有较强较强抵抗性能耐受零度以下到抵抗性能耐受零度以下到6060；uu对对酸碱和去酸碱和去污剂污剂等具有等具有较强较强的抵抗性的抵抗性 ( (通常通常10ppm10ppm或或10mg/L10mg/L含含氯氯去去污剂处污剂处置置3030分分钟钟不能有效不能有效杀灭杀灭病原体；病原体；uu无法培育，无有效小无法培育，无有效小动动物模型；物模型；uu型型别别众多，无有效众多，无有效维护维护性抗体，常引起反复感染；性抗体，常引起反复感染；uu复制机制复制机制还还不清楚，无有效治不清楚，无有效治疗药疗药物及疫苗物及疫苗病原学：TaxonomyTaxonomyFamily CaliciviridaeFamily Caliciviridae Genus: Genus:1. Norwalk-Like Viruses (NLVs)1. Norwalk-Like Viruses (NLVs)2. Sapporo-Like Viruses (SLVs)2. Sapporo-Like Viruses (SLVs)Genus NorovirusesGenus Noroviruses(formerly Norwalk-Like Viruses)(formerly Norwalk-Like Viruses)Genus Lagovirus (rabbit, hare)Genus Lagovirus (rabbit, hare)Genus Vesivirus (cat, pig, sea lion, other)Genus Vesivirus (cat, pig, sea lion, other)Genus Norovirus (human, bovine, swine, mouse)Genus Norovirus (human, bovine, swine, mouse)Genus Sapovirus (human, swine)Genus Sapovirus (human, swine)Virions ( 35 -40 nm ) nonenveloped and icosahedral Genome structureGenome structure：Linear positive sense RNA of 7.4 - 7.7 kbLinear positive sense RNA of 7.4 - 7.7 kb53HelProPolORF 1ORF 2ORF 3155358537469506950758876541789530212CapsidSource: GenBank M87661GIII.1_JenaGIII.2_CH126GI.3_Desert ShieldGI.7_WinchesterGI.8_BoxerGI.4_ChibaGI.5_MusgroveGI.2_SouthamptonGI.6_HesseGI.1_NorwalkGV.1_MurineGIV.1_AlphatronGII.15_J23GII.4_BristolGII.11_SW918GII.8_AmsterdamGII.9_Virginia BeachGII.14_M7GII.7_LeedsGII.12_WortleyGII.1_HawaiiGII.16_TiffinGII.2_MelkshamGII.5_HillingdonGII.10_ErfurtGII.13_FayettevilleGII.17_CS-E1GII.3_TorontoGII.6_Seacroft.10GVGIVGIIIGIIGIClusters differ by 20% amino acid pairwise distanceGenogroups differ by 44-55% amino acid pairwise distance病毒的分型Capsid protein)1病毒培育：Cell culture: no (human strains)Animal model: no (chimpanzees)流行流行现现状：状：Causes an estimated 23 million infections per year in the Causes an estimated 23 million infections per year in the USUSCauses 60% of illness due to knownCauses 60% of illness due to knownAccounts for 70-95% of gastroenteritis outbreaksAccounts for 70-95% of gastroenteritis outbreaks感染感染剂剂量量: 10-100 viruses: 10-100 viruses：传传播途径：播途径： Fecal-oral transmission (shedding for up to 2-3 weeks) Fecal-oral transmission (shedding for up to 2-3 weeks) Droplet transmission? (via ingestion of airborne Droplet transmission? (via ingestion of airborne droplets of virus containing particles) droplets of virus containing particles) Common cause of travelers diarrhea Common cause of travelers diarrhea May cause chronic infection in transplant recipients May cause chronic infection in transplant recipients流行病学：传播途径：粪粪- -口传播口传播 Person-to-person Person-to-person Foodborne Foodborne Waterborne Waterborne Mixed Mixed空气传播空气传播 Vomitus Vomitus污染物污染物 传播途径分类：临床病症：腹泻86%呕吐78%腹部疼痛或绞痛 30%恶心无呕吐 15%嗜睡8%发热7%肌肉疼痛7%头痛6%头晕4%脱水4%寒颤3%喉咙疼痛1%鼻出血1%感染继续过程：病毒颗粒继续释放过程：诊断：急性胃肠炎诊断规范美国急性胃肠炎诊断规范美国CDCCDC规范规范) )： 腹泻等于腹泻等于3 3次或者多于次或者多于3 3次不成形粪便次不成形粪便/24h;/24h;呕吐呕吐伴随一种以下病症如：伴随一种以下病症如：1 1次或多次不成形便次或多次不成形便24/h24/h、胃部不适、头疼、肌肉疼痛和发烧。胃部不适、头疼、肌肉疼痛和发烧。邮轮疫情的定义：感染者通常邮轮疫情的定义：感染者通常3%3%邮轮总人数。邮轮总人数。 实验室检测 ( (一一) )抗原检测抗原检测19721972年首先经过免疫电镜的方法发现年首先经过免疫电镜的方法发现NVsNVs，因，因此该方法在很长一段时间内成为检测此该方法在很长一段时间内成为检测NVsNVs的经典方法。的经典方法。电镜法包括常规电镜电镜法包括常规电镜EMEM、免疫电镜、免疫电镜IEMIEM以以及固相免疫电镜及固相免疫电镜SPIEMSPIEM三种。直接电镜法经过三种。直接电镜法经过将粪便标本重悬后离心，负染病毒颗粒后直接在镜将粪便标本重悬后离心，负染病毒颗粒后直接在镜下察看来寻觅病毒。由于下察看来寻觅病毒。由于NVsNVs病毒颗粒并不具备典型病毒颗粒并不具备典型的杯状病毒特征，且粪便中病毒滴度通常较低，给的杯状病毒特征，且粪便中病毒滴度通常较低，给直接电镜察看带来了很大困难，通常要求病毒的滴直接电镜察看带来了很大困难，通常要求病毒的滴度到达度到达106/g106/g才干到达检测要求。免疫电镜的方法是才干到达检测要求。免疫电镜的方法是将重悬离心分别得到的病毒颗粒与规范血清共孵育将重悬离心分别得到的病毒颗粒与规范血清共孵育后再经负染后在镜下察看来检测病毒。虽然这种方后再经负染后在镜下察看来检测病毒。虽然这种方法可以较好地浓缩病毒颗粒，但灵敏度依然较低，法可以较好地浓缩病毒颗粒，但灵敏度依然较低，对对NVsNVs检测的阳性率只需检测的阳性率只需20%20%左右。固相免疫电镜左右。固相免疫电镜的方法是将特异性抗体直接包被载网，同时参与蛋的方法是将特异性抗体直接包被载网，同时参与蛋白白A A添加抗体与标本中抗原结合的时机，从而提高检添加抗体与标本中抗原结合的时机，从而提高检测的灵敏度。上述三种方法都要求察看者具有丰富测的灵敏度。上述三种方法都要求察看者具有丰富的阅历，同时，精细的检测仪器、较大的劳动强度，的阅历，同时，精细的检测仪器、较大的劳动强度，都制约了该方法在都制约了该方法在NVsNVs检测中的运用。检测中的运用。 免疫学检测EIA主要经过检测标本中的抗原来确认诺如病毒。该方法操作简单，适用性较强，便于推行。然而同样由于NVs型别的多样性，对该方法的运用产生了限制。 Bruin等在2019年初次报告了对两种新上市的商品化NVs EIA检测试剂盒的评价结果。结果阐明，与传统的RT-PCR方法相比，IDEIA和Ridascreen这两个品牌的试剂盒对NVs的检测灵敏度分别为38%和36%，特异性为96%和88%。之后的两项评价结果虽然有提高，但灵敏度也仅在60.%76.9%和59%80.3%之间。阐明虽然对单个样品的诊断能够还存在问题，但可运用于NVs大规模迸发后的筛查。 ( (二二) )核酸检测核酸检测 逆转录聚合酶链反响(RT-PCR)：除了能更准确、灵敏地检测标本中的诺瓦克病毒，尤其是低浓度的诺瓦克病毒感染外，最大的优点在于可以进一步对病毒进展血清型和基因型的研讨，不会遭到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研讨具有重要意义，是诺如病毒检测的“金规范。Specimen Processing (Faeces)Specimen Processing (Faeces)Viral Recovery & RNA extractionViral Recovery & RNA extractionGenerate cDNA from RNA by reverse transcriptionGenerate cDNA from RNA by reverse transcriptionPCRPCRNorovirus Genogroup I or II identifiedNorovirus Genogroup I or II identified Sequencing SequencingGenotypingGenotyping实验流程：实验流程：第三部分 一同邮轮诺如病毒感染疫 情的实验室检测根本情况引见 2019 2019年年1111月月4 4日，日， 上海出入境检验检疫局接某大型邮上海出入境检验检疫局接某大型邮轮报告，该船载有乘客轮报告，该船载有乘客26642664人，乘务人员人，乘务人员10871087人，自人，自1010月月2222日从泰国曼谷起航后，船上陆续发现急性胃肠炎感染病日从泰国曼谷起航后，船上陆续发现急性胃肠炎感染病例。感染人数在例。感染人数在1111月月2 2日和日和3 3日到达顶峰，至日到达顶峰，至1111月月4 4日已达日已达285285人截止人截止1111月月6 6日符合急性胃肠炎病症的病例达日符合急性胃肠炎病症的病例达368368人人。上海出入境检验检疫局在接到报告后迅速启动紧急预。上海出入境检验检疫局在接到报告后迅速启动紧急预案，多个部门通力协作，开展现场检疫查验和流行病学调案，多个部门通力协作，开展现场检疫查验和流行病学调查，明确事件性质；实验室迅速开展急性胃肠炎相关病原查，明确事件性质；实验室迅速开展急性胃肠炎相关病原的快速检测，在收到样品后的快速检测，在收到样品后3 3小时就初步确认引起这次大小时就初步确认引起这次大规模急性胃肠炎的病原为诺如病毒。这是检验检疫系统初规模急性胃肠炎的病原为诺如病毒。这是检验检疫系统初次在口岸确诊大规模诺如病毒迸发疫情。次在口岸确诊大规模诺如病毒迸发疫情。 Unpublished results by Wang J. and Zhang Z.实验室诊断处置根据：实验室诊断处置根据： 诊断原那么诊断原那么首先排除检疫传染病霍乱首先排除检疫传染病霍乱流行病学调查资料流行病学调查资料临床病症临床病症其它相关资料其它相关资料确定检测工程，检测方法排查方案一一轮状病毒：一轮状病毒：1 1 金标法检测轮状病毒抗原金标法检测轮状病毒抗原试剂：粪便轮状病毒检测试剂盒；试剂：粪便轮状病毒检测试剂盒；试剂厂家：法国试剂厂家：法国VEDAVEDA公司；公司；样本：粪便；样本：粪便；时间：时间：3030分钟。分钟。2 2ELISAELISA法法试剂：轮状病毒酶免检测试剂盒；试剂：轮状病毒酶免检测试剂盒；供应商：上海轩昊科技开展供应商：上海轩昊科技开展样本：粪便；样本：粪便；时间：时间：2 2小时。小时。3 3荧光定量荧光定量RT-PCRRT-PCR法法试剂：轮状病毒荧光定量试剂：轮状病毒荧光定量RT-PCRRT-PCR检测试剂盒；检测试剂盒；单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所；单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所；样本：粪便；样本：粪便；时间：时间：4 4小时。小时。二诺如病毒二诺如病毒1 1ELISAELISA法检测病毒抗原法检测病毒抗原试剂：试剂：Enzyme immunoassay for the detection of Norovirus in stool samplesEnzyme immunoassay for the detection of Norovirus in stool samples；厂家：厂家：R-Biopharm AGR-Biopharm AG；样本：粪便；样本：粪便；时间：时间：4 4小时。小时。2 2半定量半定量RT-PCRRT-PCR法本实验室法本实验室样本：粪便；样本：粪便；时间：时间：6 6小时。小时。排查方案二结果：ELISAELISA检测结果：检测结果：RT-PCRRT-PCR检测结果：检测结果：TIPS: for sample cellection1.最好采集水样便或稀便；2.最好采集发病48-72小时之间的粪便样本；3. 直肠拭子或呕吐物标本普通作参考电镜病毒颗粒察看结果电镜病毒颗粒察看结果磷钨酸负染，40,000 电镜察看检测过程总结：诺如病毒进一步研讨方向：诺如病毒进一步研讨方向：快速快速检测检测方法：方法：Latex, LAMP,NASBA?Latex, LAMP,NASBA?分子流行病学：分子流行病学：陆陆地地海洋循海洋循环进环进化化规规律律消消杀试剂杀试剂本次疫情处置的阅历得失：本次疫情处置的阅历得失：我国口岸首例，胜利处置，找到病原体；我国口岸首例，胜利处置，找到病原体；锻炼了队伍，加强了职责、使命感，强化了疫情锻炼了队伍，加强了职责、使命感，强化了疫情的观念；的观念；为口岸卫生检疫科研的开展、技术的贮藏明确了为口岸卫生检疫科研的开展、技术的贮藏明确了方向；方向；各项细节有待完善各项细节有待完善邮轮突发传染病疫情相关动向：邮轮突发传染病疫情相关动向： 军团菌：军团菌： Legionella species colonization of water distribution Legionella species colonization of water distribution systems, pools and air conditioning systems in cruise systems, pools and air conditioning systems in cruise ships and ferries. BMC Public Health. 2019,8:390. ships and ferries. BMC Public Health. 2019,8:390. 流感病毒：流感病毒： A large outbreak of influenza A and B on a cruise A large outbreak of influenza A and B on a cruise ship causing widespread morbidity. Epidemiol Infect. ship causing widespread morbidity. Epidemiol Infect. 2019,130(2):263-71. 2019,130(2):263-71. Large summertime influenza A outbreak among Large summertime influenza A outbreak among tourists in Alaska and the Yukon Territory. Clin Infect Dis. tourists in Alaska and the Yukon Territory. Clin Infect Dis. 2019,36(9):1095-102. 2019,36(9):1095-102.