抗磷脂综合征抗磷脂综合征及实验室诊断及实验室诊断抗磷脂综合征抗磷脂综合征抗磷脂综合征抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome, APS)是一组以反复发生动脉、静脉血栓或和习惯性流产为临床表现,伴持续性抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody APL)或抗2糖蛋白I(2GPI)抗体阳性,且多系统受累的非炎症性自身免疫性疾病,又称抗磷脂-血栓综合征(antiphospholipid-thrombosis syn-drome, APL-T)。抗磷脂综合征(APS)的相关抗体包括:抗磷脂抗体（APL）、抗2GPI抗体、抗凝血酶原抗体(a-PT)、强联蛋白（Annexin）抗体、抗磷脂酸抗体及抗磷脂酰丝氨酸抗体等。抗磷脂抗体APL主要包括: 狼疮抗凝物(lupus anticoagulant, LA) 抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibody, ACA) 抗磷脂综合征的主要辅助因子及抗体抗磷脂综合征的主要辅助因子及抗体磷脂自身的抗原性较弱，只有与某些蛋白质形成磷脂蛋白复合物才能有较强的抗原性。故这些蛋白质为重要的辅因子。目前认为以凝血酶原、 2GPI、强联蛋白V 等，为抗磷脂抗体最重要的辅因子。 抗磷脂综合征的主要抗体抗磷脂综合征的主要抗体 狼疮抗凝物狼疮抗凝物LA 狼疮抗凝物 LA是1952年Conley和Hartmann最早在SLE患者血清中发现的一种在体外试验中具有延长依赖磷脂的凝血试验的免疫球蛋白,后发现LA也存在于其他免疫性疾病患者,甚至健康人体内。 在体外, LA可不依赖靶蛋白而通过结合磷脂以及抑制磷脂表面发生的凝血反应,从而干扰依赖磷脂的凝血过程起抗凝作用。抗磷脂综合征的主要抗体抗磷脂综合征的主要抗体狼疮抗凝物狼疮抗凝物在体内, LA通过作用于靶蛋白:凝血酶原、PC、2GPI等,促进血栓的形成。如LA与凝血酶原结合,可促进凝血酶原与内皮细胞表面的磷脂结合及凝血酶原的活化;LA与2GPI结合,可诱导血管内皮细胞、单核细胞表达TF。有学者在回顾1988年到2000年LA、ACA (抗心磷脂抗体)与血栓形成关系的相关文献时指出: LA是APS血栓形成的重要危险因素;在总的血栓事件中,LA阳性患者血栓形成的相对危险度大于ACA阳性患者。抗磷脂综合征的主要抗体抗磷脂综合征的主要抗体 抗心磷脂抗体抗心磷脂抗体ACA最早用于梅毒血清检测, 1983年Harris和Coworkers发现某些无梅毒感染患者血清中ACA也阳性。此后实验发现ACA不仅存在于狼疮患者体内,同时也存在于非狼疮患者中如自身免疫性、感染性、淋巴增生性疾病。 ACA与LA存在交叉反应, ACA与多数带负电荷的磷脂也有交叉反应。抗磷脂综合征的主要抗体抗磷脂综合征的主要抗体 抗心磷脂抗体抗心磷脂抗体APS患者体内的aCL与心磷脂结合时需要2-GPI的参与,2-GPI的存在使aCL与心磷脂的结合增强,称为2-GPI依赖的aCL。而在一些感染性疾病如梅毒时, aCL可直接与心磷脂结合,2-GPI的存在使其结合受到抑制,称为非2-GPI依赖的aCL。 ACA是动脉血栓形成的危险因素,与静脉血栓形成的相关性较小抗磷脂综合征的主要辅助因子及抗体抗磷脂综合征的主要辅助因子及抗体2GPI及抗及抗2GPI抗体抗体2GPI及抗2GPI抗体2GPI由肝细胞分泌的血浆糖蛋白,参与乳糜微粒、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白等的组成,在脂肪的代谢和转运中起着一定作用,故称为载脂蛋白H ( apoH)。 2GPI被认为是一种天然的抗凝剂,在体外有明显的抑制凝血的作用:抑制F的活性及激活PC的抗凝作用;也可直接与F结合,抑制凝血酶及F对F的激活。2GPI及抗及抗2GPI抗体抗体2GPI具有与磷脂结合的性质，通过与磷肥结合，对内源系统凝血因子的功能起抑制作用，但若体内存在ALA与磷脂 2GPI复合物起反应时， 2GPI的抗凝作用受抑，其抑制凝血因子与抑制血小板聚集的功能消失，从而有助于形成高凝状态，促进血栓的形成。2GPI及抗及抗2GPI抗体抗体抗2GPI抗体包括IgG、IgM及IgA, IgG与血栓密切相关。抗2GPI抗体与2GPI结合,可促进2GPI与细胞膜表面磷脂稳定结合,从而干扰依赖磷脂的抗凝途径;主要是PC抗凝途径,增加了血栓形成的危险性。抗2GPI抗体还能促使2GPI与血管内皮细胞、单核细胞及血小板相关受体(血管内皮细胞上的Toll-like receptor,单核细胞上的annexin A2、血小板上的apo ER2 )结合,诱导血管内皮细胞、单核细胞表达组织因子(TF),而发挥其促凝作用。抗2GPI抗体同时也可激活血小板,诱导血栓素产生增加,促进血栓形成。2GPI及抗及抗2GPI抗体抗体也有学者报道抗2GPI抗体能抑制2GPI与vWF结合,而解除2GPI对vWF诱导血小板聚集的抑制。近年来许多研究表明抗2-GPI抗体不仅是血管血栓和妊娠丢失的独立危险因素,并且对APS的诊断较aCL特异性更高。有学者认为,联合检测抗2-GPI抗体和IgG型aCL是诊断APS的最佳方案。a-PTa-PT是1983年Bajal等在LA阳性的低凝血酶原血症患者血清中首先发现的,后来又有学者发现a-PT也具有LA活性。a-PT在凝血酶原分子上的识别结合位点目前尚不十分清楚,Bajaj等报道1例LA阳性的低凝血酶原血症病人的a-PT可以识别凝血酶原和前凝血酶1,但不与凝血酶原的裂解片段(片段1、F1和片段2、F2)结合。也有学者报道a-PT能识别凝血酶和F1。因前凝血酶1和F1都位于凝血酶原氨基端,所以认为a-PT主要识别凝血酶原氨基端的抗原表位。凝血酶原的氨基端与其它维生素K依赖性抗凝血因子(PC和PS)具有同源性,因此a-PT也可识别并结合PC和PS,抑制PC抗凝途径。a-PT与凝血酶原结合后,促进后者与磷脂结合,引起磷脂表面的凝血酶原增加;与a-PT结合的凝血酶原仍可被活化成为凝血酶,促进血栓形成。Annexin蛋白家族即强联蛋白,又称胎盘抗凝蛋白-I。现已发现的Annexin蛋白有20多种, Annexin蛋白具有介导各种蛋白的生物活性,参与细胞信号的转导、影响酶的活性、影响细胞的结构组成、调控炎症反应、细胞分化等作用。Annexin-2和Annexin-5在抗凝及纤溶中起主要作用,与APS血栓形成密切相关。内皮细胞、胎盘合胞体滋养层细胞的表面均有Annexin-2表达,其可与纤溶酶原(plasminogen ,PLG)及tPA结合,作为辅因子促进tPA对PLG激活。抗Annexin-2抗体可抑制Annexin-2的上述作用。Annexin-2作为2GPI高亲和力受体,在2GPI存在时,抗2GPI可通过2GP与Annexin-2结合黏附于内皮细胞表面,激活内皮细胞表达黏附分子7。Annexin-5具有很强抗凝活性,对磷脂有高的亲和力,可与凝血因子竞争磷脂结合位点,从而阻止细胞膜磷脂表面的凝血反应。APL通过与Annexin-5竞争磷脂结合位点,干扰Annexin-5与带负电荷的磷脂的结合,使其不能发挥抗凝作用。Rand等报道抗Annexin抗体与Annexin-5结合后,使胎盘滋养层细胞表面的Annexin-5表达减少,从而降低Annexin-5的抗凝作用,及促进凝血酶的产生,导致胎盘血栓形成8。目前公认Annexin抗体是导致APS习惯性流产的独立危险因子。APS诱发血栓形成的机制APS分原发性和继发性两类, 前者无任何诱因 后者多继发于系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythema-tosus, SLE)、类风湿性关节炎、干燥综合征等结缔组织疾病,也可继发于各种感染与肿瘤等。APS血栓形成的机制尚未完全清楚,可能涉及多个病理环节。目前已明确APS的相关抗体为APS的主要致病因素。APS的病理基础是体内凝血及纤溶机制的异常造成的全身血管内血栓形成。由于APS的靶抗原及抗体的异质性,因而APS血栓形成的发病机制也是多途径的,可能与如下因素有关:APL导致血栓形成的主要机制 APL抑制体内正常抗凝物质的反应 APL抑制活化的蛋白C(activated protein C,APC)及APC活化途径中的凝血酶调节蛋白,或通过磷脂-2-GPI复合物与PC结合,导致PC功能障;APL通过竞争磷脂酰乙醇胺而干扰PC途径,引起活化蛋白C抵抗现象(acquired protein C resistance,APCR); APL抑制抗凝血酶的活性; APL抑制体内正常抗凝物质的反应 APL抑制膜联蛋白V(annexin V)的抗凝活性; APL抑制2-GPI的抗凝活性。aPL导致血栓形成的主要机制 aPL引起一系列细胞介导的反应aPL活化单核细胞,使其表达组织因子(tissue factor,TF),从而导致体内凝血反应,引发血栓形成;aPL活化血管内皮细胞,使其表达TF和黏附分子,促进凝血活性增强,引发血栓形成;aPL抑制纤溶酶的活性,从而降低纤溶系统对纤维蛋白的降解作用促进血栓形成;aPL引起一系列细胞介导的反应aPL与血管内皮细胞的磷脂结合后使内皮细胞功能受损,导致前列腺素的合成及释放减少,而前列腺素有重要的抗血小板凝集和扩血管作用。aPL与血小板膜磷脂结合导致血小板活化。抗磷脂综合征诊断标准该标准包括临床和实验室两方面内容: 临床指标有血管血栓形成和(或)妊娠丢失或新生儿异常; 实验室指标包括狼疮抗凝物( LA)和(或)IgG类或IgM类抗心磷脂抗体( aCL)阳性。 至少同时符合一项临床指标和一项实验室指标才能诊断为APS。抗磷脂综合征诊断标准2005年在悉尼举行的国际血栓止血学会(ISTH)会议提出了APS诊断标准的修改意见,对APS的诊断提出了许多更详细的新规定。修订标准仍然分为临床和实验室两方面内容,须同时符合一项临床指标和一项实验室指标方能诊断为APS。临床指标有两项:血管血栓形成:影像学或组织病理学确定的任何组织或器官动脉、静脉或更小血管的血栓形成(组织病理学诊断为血栓时血管壁必须无明显炎症)。妊娠丢失:(a)1次以上无法解释的妊娠10周以上形态正常的胎儿(超声或直接胎儿检查)死亡,或(b)1次以上由于子痫、严重先兆子痫或胎盘功能不全引起的早产(妊娠34周,胎儿形态正常),或(c)3次以上不明原因的早期自发性流产(妊娠40单位),或滴度达到正常人群水平的99%以上。检测间隔至少12周,采用标准ELISA法。血浆或血清IgG类或IgM类抗2糖蛋白I(2-GP I)抗体2次阳性,滴度达到正常人群水平的99%以上。检测间隔至少12周,采用标准ELISA法抗心磷脂抗体(anticardiolipin,ACA)的实验室检测抗心磷脂抗体(anticardiolipin,ACA)是一种以血小板和内皮细胞膜上带负电荷的心磷脂作为靶抗原的自身抗体. 常规采用ELISA检测，其优点在于避免了凝血因子缺乏与抗凝剂的影响。在同种型中C以IgM最临床意义，IgG次之，IgA几无临床意义。ACA不是LA的替代试验，而是另一种特质性抗体，故当病史与ACA阳性，即使LA阴性，亦可诊断为APS。但若ACA滴度过低，则无诊断意义。狼疮抗凝物的实验室检测LAC筛选试验较常用的有：活化部分凝血活酶时间(APTT)、白陶土凝集时间(KCT)、凝血酶原时间(PT)、蝰蛇毒凝集时间(dRVVT)和凝血酶时间(TT),其中最常用的是APTT、PT。LAC阳性者APTT、KCT、PT、RVVT延长,其中以APTT、KCT最敏感。狼疮抗凝物的实验室检测APTT、PT异常可见于:纤维蛋白原、F、F、F缺乏(APTT延长可被1/10正常的新鲜血浆所纠正)。类肝素样物质增多(APTT延长不能被等量正常血浆纠正)。LAC增多(患者的血浆与正常血浆等量混合检测,APTT仍超过正常对照4倍,但可被洗涤后冻融的血小板纠正)。因此,筛选试验异常时需要进行确诊试验。狼疮抗凝物的实验室检测LAC确诊试验改良的Russell蝰蛇毒稀释确诊试验:Lupo试验:当蝰蛇毒凝集时间延长时,加正常乏血小板混合血浆后,蝰蛇毒凝集时间仍然延长,不被纠正,提示被检血浆中存在狼疮抗凝物。Lucor试验:即为纠正实验。补充外源性磷脂,磷脂能中和狼疮抗凝物质,从而使蝰蛇毒试验被纠正,时间缩短或正常。此试验简便而具有特异性,是狼疮抗凝物的确诊试验。正常Lupo试验为31-44 s,Lucor试验为30-38 s,Lupo试验/Lucor试验比值为。Lupo试验比正常延长20%,Lupo试验/Lucor试验比值大于1.2,提示有狼疮抗凝物质存在。Lupo试验/Lucor试验比值大于2.1,表示有大量狼疮抗凝物质存在;Lupo试验/Lucor试验比值为1.5-2.0,表示中等量狼疮抗凝物质存在;Lupo试验/Lucor试验比值为1.3-1.4,表示少量狼疮抗凝物质存在。Lupo试验和(或)Lucor凝固时间延长,Lupo试验/Lucor试验比值小于1.2,也可出现于因子、缺乏的患者,或者应用华法林或肝素等患者。Lupo试验异常延长,但能被正常血浆纠正,提示因子、缺乏。当蝰蛇毒试验延长时不能被正常血浆纠正,亦不能被外源性磷脂纠正,可见于类肝素样抗凝物质增多。LAC检测的筛选试验和确诊试验对诊断LAC的特异性强,但有时APTT可以正常。因此,必要时可做多个筛选试验。正常血正常血浆 +病人血病人血浆 混合混合 实验实验实验1:实验2:确确诊实验确确诊LA孵育混合血浆孵育混合血浆纠正正实验 1:筛选实验实验 2:停止停止对LA的的检测正常正常不正常不正常不能不能纠正正纠正正不能不能纠正正因子因子检测因子缺乏因子缺乏纠正正国际组织推荐的狼疮抗凝物检测流程国际组织推荐的狼疮抗凝物检测流程-对狼疮抗凝物敏感-应用2个不同的原理-低浓度磷脂特殊抑制物磷脂依赖的正常正常按照国际组织推荐流程采用按照国际组织推荐流程采用Diagnostica Stago 试剂试剂检测狼疮抗凝物检测狼疮抗凝物正常血正常血浆 +病人血病人血浆 混合混合 实验实验实验1:实验2: 确诊确诊 实验实验确确诊LA孵育混合血浆孵育混合血浆纠正正不正常不正常不能不能纠正正正常正常不正常不正常因子因子检测因子缺乏因子缺乏纠正正特殊抑制物实验 1:筛选实验实验 2:停止停止对LA的的检测正常正常正常正常PTT-LASTA Staclot DRVV ScreenStaclot LASTA Staclot DRVV Confirm