综合实验综合实验二二人乙醛脱氢酶人乙醛脱氢酶2 (ALDH2)多态性分析多态性分析 -PCR-APLP以及以及PCR 产物产物电泳鉴定及结果分析电泳鉴定及结果分析（一）基因组抽提（二）（二）（二）（二）PCR-APLPPCR-APLP（三）PCR产物电泳鉴定及结果分析综合实验综合实验已经完成已经完成PCR反应液配置反应液配置2*MasterMix10l模板-即抽提的基因组DNA片段3l引物(AL1+AL3)or(AL2+AL3)2lH2O5l每个样品分每个样品分每个样品分每个样品分2 2管进行扩增管进行扩增管进行扩增管进行扩增PCR反应条件反应条件（DNA扩增仪设定反应条件）扩增仪设定反应条件）预变性：9410min模板DNA的变性：9430sec模板DNA与引物的退火：5830sec引物延伸：7230sec末次循环后延伸：7210min保温：10Hold注意：注意：PCR试管做好记号试管做好记号39个个循循环环多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）类似于DNA的天然复制过程：经过变性、退火、延伸多次循环,DNA扩增倍数可达2n倍。PCR是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。PCR技术简史技术简史 1985年，美国年，美国PE-Cetus公司公司的的Mullis等人发明等人发明PCR 基本原理是在试管中模拟细基本原理是在试管中模拟细胞内的胞内的DNA复制复制 1993年，年，Mullis等因此项技等因此项技术获诺贝尔化学奖术获诺贝尔化学奖引物引物引物引物Mullis的构思的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNA片段片段片段片段Taq DNA聚合酶聚合酶酶酶酶酶活活活活性性性性( (%) )温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 2094变性变性50-65退退火火72延伸延伸7272延伸延伸延伸延伸9494变性变性变性变性50-6550-65退火退火退火退火PCRPCR循环循环循环循环22557294时间（min）温度（）PCR的基本原理的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95第1轮结束第2轮开始PCR的特点的特点 灵敏度高灵敏度高 简便、快速简便、快速 对对标标本本的的纯纯度度要要求求低低，血血液液、体体腔腔液液、洗洗嗽嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 引物设计引物设计 引物长度以引物长度以15-40 bp为宜为宜 碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布，G+C占占50-60% 引物内部避免形成二级结构引物内部避免形成二级结构 两引物间避免有互补序列两引物间避免有互补序列PCR的反应体系的反应体系TaqDNA聚合酶2.5U4种dNTP混合物各200mol/L引物各10100pmol模板DNA0.12gMg2+1.5mmol/L 模模板板浓浓度度一一般般为为100 ng/100 L，浓浓度度过过高高会导致反应的非特异性增加会导致反应的非特异性增加 不不能能混混有有蛋蛋白白酶酶、核核酸酸酶酶、DNA聚聚合合酶酶抑抑制剂、制剂、DNA结合蛋白。结合蛋白。 PCR反应条件反应条件 引引物物浓浓度度0.1-0.5 mol/L，浓浓度度过过高高易易导导致致模模板与引物错配，反应特异性下降板与引物错配，反应特异性下降 Taq DNA聚聚合合酶酶0.5-2.5 U/50 l，酶酶量量增增加加使使反应特异性下降反应特异性下降;酶量过少影响反应产量酶量过少影响反应产量 四种四种dNTP浓度应相等浓度应相等 Mg2+ 是是DNA聚合酶的激活剂，聚合酶的激活剂，0.5 2.5mmol/L基于基于PCR的扩增产物长度多态性的扩增产物长度多态性（PCR-APLP）根据已知DNA片段两端序列设计引物，一端是等位基因特异性引物，另一端是共同引物；对已知基因DNA片段再进行PCR特异扩增；特异的引物配对可以扩增出某一特异基因型的片段，根据扩增出来的DNA条带大小的差异，可以分析基因型（纯合型、杂合型）ALDH2ALDH2引物引物引物引物AL1AL15-TAGGACACT CAC AGT TTT CACCT CAC AGT TTT CACAT T C-3(78bp)AL2AL2 5-CTC TCA CAG TTT TCA CC TCA CAG TTT TCA CTT T T-3(73bp)AL3AL35-AAGATGTCGGGGAGTGG-3每个样品每个样品EP管管1 EP管管2结论结论引物引物AL1+AL3AL2+AL3条带条带出现出现78 bp不出现不出现73 bp野生型野生型纯合子基因纯合子基因条带条带不出现不出现78 bp出现出现73 bp突变型突变型纯合子基因纯合子基因条带条带出现出现78 bp出现出现73 bp野生型和突变型野生型和突变型杂合子基因杂合子基因（一）基因组抽提（二）PCR-APLP（三）（三）（三）（三）PCRPCR产物电泳鉴产物电泳鉴产物电泳鉴产物电泳鉴定及结果分析定及结果分析定及结果分析定及结果分析综合实验综合实验琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis实验原理实验原理-琼脂糖凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳技术琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。核酸凝胶电泳的基本原理核酸凝胶电泳的基本原理 核核酸酸分分子子之之糖糖- -磷磷酸酸骨骨架架中中的的磷磷酸酸基基团团，呈呈负负离离子子化化状状态态；核核酸酸分分子子在在一一定定的的电电场场强强度度的的电电场中，它们会向正电极方向迁移。场中，它们会向正电极方向迁移。 因因此此，同同一一凝凝胶胶中中、一一定定电电场场强强度度下下在在凝凝胶胶上上可可分分离离出出不不同同分分子子量量大大小小或或相相同同分分子子量量但但构构型型有差异的核酸分子有差异的核酸分子。优优优优 点点点点因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定有热可逆性缺缺缺缺 点点点点机械强度差，易破碎，浓度不能太低。易被细菌污染，不易保存，临用前配制。琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。DNA的迁移速率决定因素的迁移速率决定因素1.DNA分子的大小分子的大小 双双链链DNA分分子子迁迁移移的的速速率率与与其其碱碱基基对对数数的的常常用对数近似成反比。用对数近似成反比。2.琼脂糖浓度琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快。浓度越低，相同核酸分子迁移越快。 3.DNA的构象的构象 一般同一分子：超螺旋环状线状松弛环状一般同一分子：超螺旋环状线状松弛环状4.凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴溴化化乙乙锭锭（EB）插插入入双双链链DNA造造成成其其负负电电荷荷减减少、刚性和长度增加少、刚性和长度增加5.所用的电压所用的电压 低电压时低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比片段迁移率与所用的电压成正比Agarose gel electrophoresis 不同类型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围片段的范围浓度浓度（%）标准标准 (kb)高强度高强度(kb) 低熔点低熔点(kb)低黏度低熔点低黏度低熔点(kb)0.31-500.50.7-250.80.5-150.8-100.8-101.00.25-120.4-80.4-81.20.15-60.3-70.3-71.50.08-40.2-40.2-42.00.1-30.1-33.00.05-10.5-14.00.1-0.56.00.01-0.1电泳缓冲液电泳缓冲液 TAE、TPE及及TBE都是常用电泳缓冲液。三者相比：都是常用电泳缓冲液。三者相比：1）TAE的的缓缓冲冲容容量量最最低低，如如长长时时间间电电泳泳会会被被消消耗耗，此此时时凝凝胶的阳极一侧将发生酸性化；胶的阳极一侧将发生酸性化；2）TBE和和TPE比比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3）双双链链线线状状DNA片片段段在在TAE中中比比在在TBE或或TPE中中迁迁移移快快10%；4）对对于于高高分分子子质质量量的的DNA，TAE的的分分辨辨率率略略高高于于TBE或或TPE，对对于于低低分分子子质质量量的的DNA，TAE要要差差些些。超超螺螺旋旋DNA在在TAE中的电泳分辨率要好于中的电泳分辨率要好于TBE。 凝胶上样缓冲液凝胶上样缓冲液上样缓冲液：上样缓冲液： 上样在加样之前与待电泳的样品相混合的一种上样在加样之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。缓冲液。上样缓冲液的作用：上样缓冲液的作用： 1）增加样品密度保证）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程；）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率 向阳极迁移。向阳极迁移。琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中DNA的检测的检测 通过染色通过染色, 紫外灯下检测。紫外灯下检测。 主要有主要有溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和染色法和SYBR Green染色法。染色法。EB被认为是一种强致癌物质被认为是一种强致癌物质sybr-green- 不稳定，易降解不稳定，易降解GGelRed & elRed & GGelGreenelGreen的凝胶染色的凝胶染色的凝胶染色的凝胶染色 它它们们是是一一种种新新型型极极敏敏感感染染料料的的商商品品名名称称。其其与与DNA结结合合的的亲亲和和力力高高，并并且且结结合合后后，能能够够极大增强荧光信号。极大增强荧光信号。凝胶中凝胶中DNA的成像的成像 可可以以用用透透射射或或入入射射紫紫外外光光对对GelRed染染色色的的凝凝胶胶成成像像，图图像像可可以以直直接接输输出出到到计计算算机机观观察。察。凝胶的制备及电泳凝胶的制备及电泳制胶制胶1. 准备好凝胶成型器，插入成型梳。准备好凝胶成型器，插入成型梳。2. 将将3 g琼脂糖加至琼脂糖加至100 ml 1TAE缓冲液中，摇匀。缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化，冷却至在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化，冷却至60以下。以下。3. 加入加入10 l GelRed（1: 10000比例）至熔化的琼脂比例）至熔化的琼脂糖液中混匀，但避免出现气泡。糖液中混匀，但避免出现气泡。 4. 将冷却的将冷却的琼脂糖倒入凝胶成型器琼脂糖倒入凝胶成型器，制备凝胶。，制备凝胶。电泳电泳1. 待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约20分钟）分钟），小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。2. 用移液器吸取用移液器吸取2 l 的的6X载样缓冲液于封口膜上，载样缓冲液于封口膜上，再加入再加入5 l样品，混匀后，样品，混匀后，小心加入点样孔小心加入点样孔。 3. 接通电源，调节电压至接通电源，调节电压至4-5V/cm，DNA从负极移从负极移到正极。电泳时间到正极。电泳时间3060分钟。分钟。4. 电泳结束，关掉电源。电泳结束，关掉电源。1.将将电电泳泳完完毕毕的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶置置于于自自动动成成像像系系统统的平台中间的平台中间;2.开开通通紫紫外外光光，可可见见到到发发出出荧荧光光的的DNA条条带带，在电脑中观察图像；在电脑中观察图像；3.关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像；关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像；4.根据图像判定结果。根据图像判定结果。结果分析结果分析每个样品每个样品EP管管1 EP管管2结论结论引物引物AL1+AL3AL2+AL3条带条带出现出现78 bp不出现不出现73 bp野生型野生型纯合子基因纯合子基因条带条带不出现不出现78 bp出现出现73 bp突变型突变型纯合子基因纯合子基因条带条带出现出现78 bp出现出现73 bp野生型和突变型野生型和突变型杂合子基因杂合子基因结果展示结果展示结果展示结果展示DNAmarker_+ABCDEFG21212121212121