血清ALT活性测定吴占波、陈旻赉、刘仲春、陈军武 实验目的v生理作用v单位意义v测定方法v临床意义卡门原理v ALTv丙氨酸+a-酮戊二酸 丙酮酸+谷氨酸v NADH+H 乳酸脱氢酶 v v NAD +乳酸 v1ml血清 340nm波长 比色 25 C 1min 光密度下降0.001 实验原理v ALTv丙氨酸+a-酮戊二酸 丙酮酸+谷氨酸v OHv丙酮酸+2,4二硝基苯肼 丙酮酸2,4二硝基苯腙+H2Ov反应30min 在520nm试剂vALT底物液v磷酸缓冲液v丙酮酸标准液v2，4-二硝基苯肼溶液实验操作v1.绘制标准曲线v2.酶活性测定混匀，放置混匀，放置10分钟，以蒸馏水调零，用分钟，以蒸馏水调零，用520nm波长比色，读取各观密波长比色，读取各观密度。各管的光密度度。各管的光密度An减去减去0管（管（A0），以光密度差值（），以光密度差值（An-A0）为纵坐）为纵坐标，活性单位为横坐标。标，活性单位为横坐标。01234丙酮酸标准液（丙酮酸标准液（mlml）0 00.050.050.10.10.150.150.20.2ALTALT底物试剂（底物试剂（mlml）0.50.50.450.450.40.40.350.350.30.30.1M0.1M磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液PH=7.4(ml)PH=7.4(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1 混匀，置混匀，置37C37C水浴预温水浴预温5 5分钟分钟2,4-2,4-二硝基苯肼液（二硝基苯肼液（mlml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5 混匀，置混匀，置37C37C水浴水浴2020分钟分钟 0.4mol/LNaOH(ml)0.4mol/LNaOH(ml)5 55 55 55 55 5相当于相当于ALTALT活性（卡门氏单位）活性（卡门氏单位）0 0282857579797150150酶活性测定：去两只表明测定管T及对照管C,测定前将底物液在37 C水浴中预温5minv混匀，放置10min，用520nm波长比色，读数，用AT-AC差标准曲线，及待测血清中ALT的酶活性 v参考值 525卡 测定管测定管 对照管对照管血清（血清（mlml）0.10.1 ALTALT底物液（底物液（mlml）0.50.50.50.5 混匀，置混匀，置37C37C水浴中保温水浴中保温30min30min2,4-2,4-二硝基苯肼液（二硝基苯肼液（mlml）0.50.50.50.5 混匀，置混匀，置37C37C水浴中保温水浴中保温20min20min血清（血清（mlml） 0.10.10.4mol/LNaOH0.4mol/LNaOH（mlml）5 55 5临床意义v在肝脏疾病时，ALT的浓度会升高，机体各组织都有，肝脏中丙氨酸代谢最旺盛，含量最多发病时活性和含量均升高 葡萄糖葡萄糖6-6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖甘油甘油磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮磷酸戊磷酸戊糖途径糖途径脂肪脂肪磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸3-3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛脂肪酸脂肪酸丙酮酸丙酮酸非必须氨基酸非必须氨基酸非必需氨基酸非必需氨基酸乙酰辅酶乙酰辅酶A A酮体酮体草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸CO2CO2延胡索酸延胡索酸a-a-酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸琥珀酸琥珀酸CO2CO2注意事项v赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位，启活性与吸光度有良好的线性关系，超过时，应将血清稀释测定vA-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼产生苯腙，两种吸光度在520nm出吸光度差异大，空白管的吸光度应不超过思考题v1终止法v2赖氏与卡门的联系与区别v3标准对照法v4影响准确性较大的试剂标准对照法测定管测定管T T对照管对照管C C标准管标准管S S空白管空白管S S标准液（标准液（mlml）0.10.1血清（血清（mlml）0.10.1ALTALT底物液（底物液（mlml）0.40.40.40.40.40.40.50.5PBS(ml)PBS(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.1混匀，混匀，37 C,30min37 C,30min苯肼（苯肼（mlml）0.50.50.50.50.50.50.50.5混匀，混匀，37 C,20min37 C,20min血清（血清（mlml）0.10.1NaOHNaOH溶液溶液(ml)(ml)5 55 55 55 5谢谢！