实验五实验五肠道致病菌的微生物学检查肠道致病菌的微生物学检查结核分枝杆菌的培养及形态观察结核分枝杆菌的培养及形态观察 医学微生物学医学微生物学实验实验实验内容：实验内容：1.1.肠道致病菌的微生物学检查肠道致病菌的微生物学检查2.2.结核分枝杆菌的培养及形态观察结核分枝杆菌的培养及形态观察（抗酸染色）（抗酸染色）1.肠道致病菌的微生物学检查肠道致病菌的微生物学检查 （1）实验目的实验目的Aaaaaaaaaaaaaaaa示教：常见肠道细菌示教：常见肠道细菌（2）常用培养基介绍常用培养基介绍主要包括：麦康克培养基、主要包括：麦康克培养基、伊红美蓝伊红美蓝培养基、中国蓝琼脂平板、培养基、中国蓝琼脂平板、SS琼脂平琼脂平板、双糖铁培养基板、双糖铁培养基示教：伊红美蓝培养基示教：伊红美蓝培养基 双糖铁培养基双糖铁培养基 SS平板分离肠道病原菌的强选择培养基平板分离肠道病原菌的强选择培养基成分和作用成分和作用：基础培养基基础培养基：提供氮源和碳源：提供氮源和碳源胆盐、枸橼酸钠、煌绿胆盐、枸橼酸钠、煌绿：可抑制肠道非致病：可抑制肠道非致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱。菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱。乳糖，中性红乳糖，中性红（pH6.8-8.0pH6.8-8.0，红，红橙黄）橙黄） ：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性物质物质菌落淡黄色；大肠杆菌分解乳糖产酸，菌落淡黄色；大肠杆菌分解乳糖产酸，菌落呈红色菌落呈红色病原菌病原菌: :小小, ,无色无色非致病菌非致病菌: :大大, ,红色红色病原菌病原菌:透明透明, ,无色，小菌落无色，小菌落 非致病菌非致病菌:紫黑色紫黑色EMB（Eosin Methyl Blue)平板平板分离肠道病原菌的弱选择培养基分离肠道病原菌的弱选择培养基克氏双糖培养基克氏双糖培养基接种方法接种方法如何观察如何观察上层含乳糖部分上层含乳糖部分乳糖发酵：致病菌红色，非致病乳糖发酵：致病菌红色，非致病菌黄色菌黄色H2S然后观察下层然后观察下层发酵葡萄糖（产酸产气）发酵葡萄糖（产酸产气）动力动力乳糖乳糖硫酸亚铁硫酸亚铁固体固体葡萄糖葡萄糖半固体半固体指示剂指示剂:酚红酚红（3）肠道致病菌的分离鉴定肠道致病菌的分离鉴定标本收集标本收集分离培养分离培养初步鉴定初步鉴定血清学鉴定血清学鉴定生化反应生化反应标本标本选择鉴别培养基选择鉴别培养基 SS平板平板生化反应生化反应血清学鉴定血清学鉴定双糖管双糖管等等已知已知Ab检测检测未知未知Ag (玻片玻片凝集试验凝集试验)3724h？和球菌的不同？和球菌的不同？和球菌的不同？和球菌的不同粪便标本肠道致病菌粪便标本肠道致病菌分离鉴别流程分离鉴别流程 乳糖乳糖 葡萄糖葡萄糖 动力动力 硫化氢硫化氢大肠杆菌大肠杆菌 黄色黄色 + -痢疾杆菌痢疾杆菌 红色红色 + - -伤寒杆菌伤寒杆菌 红色红色 + + +/-鉴别肠道致病菌的生化反应鉴别肠道致病菌的生化反应糖发酵试验糖发酵试验 甲基红试验甲基红试验VPVP实验实验枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验硫化物（硫化氢）生成试验硫化物（硫化氢）生成试验吲哚生成试验吲哚生成试验尿素水解试验尿素水解试验示教：生化反应举例示教：生化反应举例 糖发酵试验糖发酵试验(fermentaton test)示教：单糖发酵管示教：单糖发酵管 甲基红试验甲基红试验（methyl red test）- + - +VP（Voges-Proskauer）试验）试验 +- Urease Test 尿素酶试验尿素酶试验：H2S Production 硫化氢试验硫化氢试验 - +IMViC试验试验(Indole Test; Methyl Red (MR) Test; Voges-Proskauer (VP) Test; Citrate Utilization Test) 大肠埃希菌大肠埃希菌 产气杆菌产气杆菌 2.2.结核分枝杆菌的培养及形态观察结核分枝杆菌的培养及形态观察发病趋势和临床意义发病趋势和临床意义：aaaaaaaaaaaaaaaaaa结核分枝杆菌结核分枝杆菌形态：形态：细长，略弯曲的杆菌，多聚集成团。无鞭毛细长，略弯曲的杆菌，多聚集成团。无鞭毛, ,芽胞。芽胞。染色性：染色性：不易着色，齐尼抗酸染色阳性。菌体呈红色，背景中不易着色，齐尼抗酸染色阳性。菌体呈红色，背景中其他物质蓝色。其他物质蓝色。培养特性：培养特性：专性需氧，最适专性需氧，最适3737 ，营养要求高，生长缓慢，营养要求高，生长缓慢，1818h h分裂一代。分裂一代。罗氏罗氏( (Lowenstein-Jensen)Lowenstein-Jensen)培养基含蛋黄、培养基含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐、孔雀绿，甘油、马铃薯、无机盐、孔雀绿，2626周可见菌落生周可见菌落生长，菜花、颗粒或结节状菌落，乳白色或黄色，不透长，菜花、颗粒或结节状菌落，乳白色或黄色，不透明。在液体培养基，生长于表面，有皱褶。明。在液体培养基，生长于表面，有皱褶。结核分枝杆菌的培养方法结核分枝杆菌的培养方法1 1痰标本培养前处理痰标本培养前处理（1 1）酸处理法：痰标本加入）酸处理法：痰标本加入4 4硫酸稀释硫酸稀释2 24 4倍，倍，置室温下置室温下30min30min，期间振荡，期间振荡2 23 3次，使痰液化后即次，使痰液化后即可接种。可接种。（2 2）碱处理法：痰标本加入）碱处理法：痰标本加入2 2氢氧化钠溶液稀释氢氧化钠溶液稀释2 24 4倍，置倍，置3737温箱内温箱内30min30min，期间振荡，期间振荡2 23 3次，次，痰液化后即可接种。痰液化后即可接种。2 2接种培养法接种培养法 取上述处理过的痰液取上述处理过的痰液0.1ml0.1ml均匀接种于改良罗氏均匀接种于改良罗氏培养基斜面，培养基斜面，3737孵育孵育3 34 4周后观察菌落特点。周后观察菌落特点。菌落为乳白色或米黄色，表面粗糙呈颗菌落为乳白色或米黄色，表面粗糙呈颗粒状或菜花状粒状或菜花状抗酸染色抗酸染色 结核杆菌对苯胺染料一般不易着色，但经结核杆菌对苯胺染料一般不易着色，但经加温或延长染色时间后能抵抗加温或延长染色时间后能抵抗3 3盐酸乙醇盐酸乙醇的脱色作用。经此法染色后，结核杆菌及其的脱色作用。经此法染色后，结核杆菌及其他分枝杆菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色。他分枝杆菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色。示教：结核分枝杆示教：结核分枝杆菌抗酸染色菌抗酸染色 实验步骤：实验步骤：1 1用竹签挑取开放性肺结核病人晨痰标本中干酪样用竹签挑取开放性肺结核病人晨痰标本中干酪样小粒或脓性部分，或小粒或脓性部分，或用取菌环用取菌环挑取经酸、碱处理挑取经酸、碱处理后的痰标本，置载玻片中央，均匀涂布成后的痰标本，置载玻片中央，均匀涂布成1.52.0cm1.52.0cm卵圆形痰膜，干燥，固定。卵圆形痰膜，干燥，固定。2 2滴加石炭酸复红液于涂片上，玻片置于酒精灯火滴加石炭酸复红液于涂片上，玻片置于酒精灯火焰缓缓加热，至有蒸汽冒出，约维持焰缓缓加热，至有蒸汽冒出，约维持5min5min（切勿切勿沸腾或使染液干涸于玻片上沸腾或使染液干涸于玻片上）。如有染液干涸趋）。如有染液干涸趋势，应补加染液。然后自然势，应补加染液。然后自然冷却冷却，用流水漂去多，用流水漂去多于染液。于染液。3 3滴加滴加3 3盐酸乙醇脱色，至涂片较厚处无颜色脱盐酸乙醇脱色，至涂片较厚处无颜色脱出为止，约出为止，约30s30s，水洗。，水洗。4 4滴加碱性亚甲蓝液复染滴加碱性亚甲蓝液复染1min1min，水洗。，水洗。5 5滤纸吸干后镜检。滤纸吸干后镜检。实验材料实验材料痰液痰液1 1管管/ /小组，抗酸染色染液小组，抗酸染色染液1 1套套/ /小组，玻小组，玻片片1 1个个/ /人人实验报告内容实验报告内容 抗酸染色法抗酸染色法实验原理、实验步骤、实验结果绘图实验原理、实验步骤、实验结果绘图和结果分析。和结果分析。