核核 酸酸 的的 物物 理理 化化 学学 性性 质质第第 13 章章 一 核酸的水解（糖苷键，磷酸二酯键）二 核酸的酸碱性质（磷酸基，碱基）三 核酸的紫外吸收（碱基）四 核酸的变性和复性 （双螺旋结构）一一 核酸的水解核酸的水解（一）酸水解：一）酸水解： 嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键对酸最不稳嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键对酸最不稳定定 嘌呤碱的糖苷键嘌呤碱的糖苷键 嘧啶碱的糖苷键嘧啶碱的糖苷键 磷酸酯键磷酸酯键（二）碱水解二）碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱水解的磷酸酯键易被碱水解2-或或3-核苷酸核苷酸 DNA对碱稳定对碱稳定,因为没有因为没有2-OH 碱水解碱水解 2-核苷酸3-核苷酸 混合物环磷酸酯（三）酶水解w磷酸二酯酶w（非特异性水解）w核酸酶 核糖核酸酶 RNase （特异性） RNaseT1w RNaseT2 w 脱氧核糖核酸酶 DNase w DNase 蛇毒磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶磷酸二酯酶（非专一性外切酶）识别5末端识别5-OH形成的磷酸酯键产生3核苷酸识别3末端识别3-OH形成的磷酸酯键产生5核苷酸蛇毒磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶531.核酸酶的分类 (1)按底物的专一性分类核糖核酸酶（ribonuclease, RNase） 脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase） (2)作用方式核酸内切酶（endonuclease）核酸外切酶（exonuclease）(3)按磷酸二酯键断裂的方式 识别3-OH的磷酸二酯键，产生5-核苷酸识别5-OH的磷酸二酯键，产生3-核苷酸(4)其它如双链酶、单链酶等2.核糖核酸酶类核糖核酸酶类(1)牛胰核糖核酸酶牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease, 简称简称RNase A或或RNase I） 只作用只作用RNA，不作用于，不作用于DNA具有极高专一性的内切酶具有极高专一性的内切酶作用位点：作用位点：嘧啶核苷嘧啶核苷-3-磷酸与其他核苷酸之间的连接键。磷酸与其他核苷酸之间的连接键。产物是产物是3嘧啶核苷酸结尾。嘧啶核苷酸结尾。(2)核糖核酸酶核糖核酸酶T1（ribonuclease T1，简称简称RNase T1） 作用位点：3G与其相邻核苷酸的5-OH之间的连键产物是3G或者以3G为末端的寡核苷酸(3)核糖核酸酶核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，简称简称RNase T2） A U C G AG 主要作用点为Ap残基，水解速度AUGC3.脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶(1)牛胰脱氧核糖核酸酶牛胰脱氧核糖核酸酶 （pancreatic deoxyribonuclease，简称，简称DNase I）作用位点：作用位点：双链双链DNA或者单链或者单链DNA，产生，产生5P为末端的寡聚核苷酸，平均长度为末端的寡聚核苷酸，平均长度4nt，需要需要Mg2+、Co2+、Mn2+激活激活最适最适pH值值7-8。(2)牛脾脱氧核糖核酸酶牛脾脱氧核糖核酸酶 （spleen deoxyribonuclease, 简称简称DNase II）作用位点：作用于DNA产生3P为末端的寡聚核苷酸，平均长度6nt需要Na2+激活,而Mg2+抑制酶活，最适pH值4-5。(3)限制性内切酶（限制性内切酶（restriction endonuclease） 简称限制酶简称限制酶 限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的的DNA，对自身起了保护作用，具有严格的碱基对自身起了保护作用，具有严格的碱基序列专一性。序列专一性。 限制性内切酶已成为基因工程重要的工具酶限制性内切酶已成为基因工程重要的工具酶 限制性内切酶的特征限制性内切酶的特征 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点点 形成的产物具有形成的产物具有 粘性末端或者平整末端粘性末端或者平整末端限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名EcoRI E为大肠杆菌E.coli属名的第一个字母，第2、3个字母co为它种名的头两个字母，第四个R表示所用大肠杆菌的菌株，最后一个罗马字表示该菌中已分离出的这一类酶的编号。Hind流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）限制性内切酶举例限制性内切酶举例1 碱基与核苷的解离：碱基与核苷的解离： 碱基解离：碱基中杂环分子中的碱基解离：碱基中杂环分子中的N以及各取以及各取代基具有结合时释放质子的能力，既有碱性代基具有结合时释放质子的能力，既有碱性解离又有酸性解离解离又有酸性解离 核苷：核糖环存在增强了碱基的核苷：核糖环存在增强了碱基的酸性解离酸性解离 二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质 碱基的解离碱基的解离 由于磷酸基的存在，是核苷酸具有较强的酸性由于磷酸基的存在，是核苷酸具有较强的酸性OOOHOHPROOOHO-PROOO-O-PRpK1=0.71.6pK2=5.96.54种核苷酸的解离曲线种核苷酸的解离曲线 胞嘧啶核苷酸的解离胞嘧啶核苷酸的解离 5种核苷酸的解离常数种核苷酸的解离常数(pKa)和等电和等电点点(pI)- 磷酸基第一次磷酸基第一次 含氮环含氮环 磷酸基第二次磷酸基第二次 含氮环含氮环 -NH- pI 羟基解离羟基解离 =N+ H- 羟基解离羟基解离 （烯醇式羟基烯醇式羟基） ( pKa1) ( pKa2) (pKa3) (pKa4)-AMP 0.9 3.8 (N1) 6.2 - 2.35GMP 0.7 2.4 (N7) 6.1 9.4 (N1) 1.55CMP 0.8 4.5 (N3) 6.3 - 2.65UMP 1.0 - 6.4 9.5 (N3) -TMP 1.6 - 6.5 10.0 (N3) -可用离子交换层析或电泳分离和鉴定核苷酸可用离子交换层析或电泳分离和鉴定核苷酸三三 核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收: : max= max= 260nm260nm1. DNA1. DNA或或RNARNA的定量测定的定量测定ODOD260260=1.0=1.0相当于相当于5050g/mlg/ml双链双链DNADNA4040g/mlg/ml单链单链DNADNA（或（或RNARNA）2020g/mlg/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNADNA纯品纯品: : ODOD260260/OD/OD280 280 = 1.8= 1.8RNARNA纯品纯品: : ODOD260260/OD/OD280 280 = 2.0= 2.0ODOD260260的应用的应用3 3 测定核酸的测定核酸的 (p)(p) 可判断可判断DNADNA制剂是否发生变性或降解。制剂是否发生变性或降解。 (p): (p): 摩尔磷吸光系数摩尔磷吸光系数 (p) = (p) = A A/ /cLcL 核苷酸核苷酸单链单链双螺旋；双螺旋； RNADNARNADNA 增色效应增色效应(hyperchromic effect)：单链多核苷酸的 (p) 比双螺旋结构的e(p)高，所以核酸发高，所以核酸发生变性后，生变性后， (p) 升高约25%，此现象称为增色效应变性DNA复性后， (p) 又降低，这种现象称为减色效应四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交（一）变性（一）变性定义定义：在某些理化因素作用下，核酸双螺旋区在某些理化因素作用下，核酸双螺旋区的氢键断裂，使变成的氢键断裂，使变成单链，并不涉及共单链，并不涉及共价键的断裂价键的断裂的过程。的过程。因素：因素：酸，碱：酸碱变性酸，碱：酸碱变性 加热加热：热变性：热变性 变性试剂如尿素、甲醛等。变性试剂如尿素、甲醛等。DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变例：变性引起紫外吸收值的改变DNADNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱TmTm：DNADNA的的变变性性作作用用发发生生在在一一个个相相当当窄窄的的温温度度范范围围内内，有有一一个个相相变变的的过过程程。通通常常把把加加热热变变性性使使DNADNA双双螺螺旋旋结结构构失失去去一一半半时时的的温温称称为为DNADNA的熔解温度的熔解温度(Tm)(Tm)。变性的特点：爆发式T TmmT Tmm影响影响Tm值值的因素的因素（1）DNA的均一性的均一性（2）介质中的离子强度）介质中的离子强度 （3）G-C含量的影响含量的影响（二）（二）DNADNA的复性的复性 DNADNA复性复性( (renaturationrenaturation) )的定义的定义在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNA的两条彼此分开的的两条彼此分开的链可重新缔合成为双螺旋构象，这一过程称为链可重新缔合成为双螺旋构象，这一过程称为复性复性。热变性的热变性的DNADNA经缓慢冷却后即可复性，这经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为一过程称为退火退火(annealing) (annealing) 。DNA的复性v复性的动力学复性的动力学热变性DNA在缓慢冷却时可以复性退火温度Tm25 ，快速冷却不能复性（淬灭）。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。两种浓度相同，但是来源不同的DNA，复性时间的长短与基因组的大小有关，具有很多重复序列的DNA，复性快 将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间在某些区域具有相同的序列，则复性时，会形成杂交DNA分子。杂交也发生在DNA和RNA之间（三）分子杂交与探针技术1Southern blotting： DNA印迹术印迹术:DNA-DNA杂交杂交2Northern blotting： RNA印迹术印迹术研究对象为研究对象为mRNA,探针一般为探针一般为 DNA3Western blotting：蛋白质印迹术蛋白质印迹术:研究对象为蛋白质，抗原研究对象为蛋白质，抗原-抗体结合抗体结合 常用的核酸分子杂交技术常用的核酸分子杂交技术第14章核酸的研究方法w核酸的分离、提纯与定量w核酸的超速离心w核酸的凝胶电泳w序列测定wDNA聚合酶链反应（PCR）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 w天然琼脂天然琼脂(agar)(agar)是一种是一种多聚糖多聚糖，主要由，主要由琼脂糖琼脂糖( (agaroseagarose，约占约占8080) )及及琼脂胶琼脂胶( (agaropectinagaropectin) )组成。组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。生较强的电渗现象。一、支持物：琼脂糖凝胶一、支持物：琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳操作简单操作简单，电泳，电泳速速度快度快，样品不须事先处理就可进行电泳。，样品不须事先处理就可进行电泳。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶结构均匀结构均匀，对样品吸附极，对样品吸附极微，因此电泳微，因此电泳图谱清晰图谱清晰，分辨率高分辨率高。优优 点点电泳后区带电泳后区带易染色易染色，样品，样品易洗脱易洗脱，便，便于定量测定。制成干膜可长期保存。于定量测定。制成干膜可长期保存。琼脂糖透明琼脂糖透明无紫外吸收无紫外吸收，电泳过程，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。测定。琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用二、二、 DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳依据：依据：DNADNA的相对分子质量的相对分子质量分子构型分子构型凝胶的浓度凝胶的浓度电压电压在凝胶中，在凝胶中，DNADNA片段迁移距离片段迁移距离( (迁移率迁移率) )与与碱碱基对基对的对数成的对数成反比反比，因此通过已知大小的标，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。比较，便可测出未知片段的大小。1 1核酸分子大小核酸分子大小w不同大小的不同大小的DNADNA需要用不同浓度的琼脂糖需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。凝胶进行电泳分离。2 2琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度 w1 1、凝胶类型、凝胶类型 w琼脂糖凝胶电泳可分为琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型垂直型及及水平型水平型( (平板平板型型) )。w目前更多用的是水平型，因为它制胶和加样目前更多用的是水平型，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而受到人们的欢迎。因而受到人们的欢迎。三、三、 电泳操作电泳操作w2 2、缓冲液系统、缓冲液系统 w常用的电泳缓冲液有：常用的电泳缓冲液有：wEDTAEDTA(pH8.0)(pH8.0) wTrisTris- -乙酸乙酸(TAE) (TAE) wTrisTris- -硼酸硼酸(TBE)(TBE)或或TrisTris- -磷酸磷酸(TPE)(TPE)等等3 3电泳方法电泳方法w（1 1）凝胶的制备）凝胶的制备 w以稀释的以稀释的电极缓冲液电极缓冲液为溶剂，用沸水为溶剂，用沸水浴配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶浴配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却约约30min30min。（2 2）样品配制与加样样品配制与加样 DNADNA样品用适量样品用适量TrisTris-EDTA-EDTA缓冲液溶解缓冲液溶解，缓冲液内含有缓冲液内含有O.25O.25溴酚蓝溴酚蓝指示染料，指示染料，含有含有10101515蔗糖或蔗糖或5 51010甘油，甘油，以增加其比重，使样品集中。以增加其比重，使样品集中。w溴酚蓝溴酚蓝是带有负电荷的小分子有色物是带有负电荷的小分子有色物质，用于监测电泳的行进过程质，用于监测电泳的行进过程w（3 3）电泳）电泳 w琼脂糖凝胶分离大分子琼脂糖凝胶分离大分子DNADNA实验条件的实验条件的研究结果表明：在研究结果表明：在低浓度低浓度、低电压低电压下，下，分离效果较好分离效果较好。在低电压条件下，线性。在低电压条件下，线性DNADNA分子的分子的电泳迁移率电泳迁移率与所用的电压与所用的电压呈呈正比正比。但是，在电场强度增加时，较大。但是，在电场强度增加时，较大的的DNADNA片段迁移率的增加相对较小。因片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离降，为了获得电泳分离DNADNA片段的最大片段的最大分辨率，电场强度不宜高于分辨率，电场强度不宜高于5 V5 Vcmcm。w(4)(4)染色和拍照染色和拍照 w 常用荧光染料溴乙锭常用荧光染料溴乙锭(EB)(EB)染色，在染色，在紫外光紫外光下观察下观察DNADNA条带，用紫外分析条带，用紫外分析仪拍照，或用仪拍照，或用凝胶成像系统凝胶成像系统输出照输出照片，并进行有关的数据分析。片，并进行有关的数据分析。聚合酶链反应（）生物样品生物样品生物样品生物样品DNADNA片段片段基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗基基基基因因因因工工工工程程程程产产产产品品品品法法法法医医医医学学学学检检检检测测测测人人人人类类类类学学学学研研研研究究究究基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA获取特定获取特定获取特定获取特定DNADNADNADNA片段片段片段片段扩扩扩扩增增增增特特特特定定定定D D D DN N N NA A A A片片片片段段段段9494949455553737Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性( ( ( (% % % %) ) ) )温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 207272949494945555PCRPCR循环循环循环循环PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/LPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理wPCR反应条件wPCR过程wPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理wPCR反应条件wPCR过程wPCR的特点9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理wPCR反应条件wPCR过程wPCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理wPCR反应条件wPCR过程wPCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理wPCR反应条件wPCR过程wPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理wPCR反应条件wPCR过程wPCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理wPCR反应条件wPCR过程wPCR的特点重复重复3030轮后轮后2 23030=1,073,741,824=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他