血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离电液实验目的（1）掌握凝胶层析的原理。（2）掌握柱层析的基本装置。（3）熟悉凝胶层析的操作过程。层析技术层析技术的概念：层析技术的概念：层析技术的概念：层析技术的概念： 任何层析都有两层任何层析都有两层: :固定相与流动相，两相互不溶固定相与流动相，两相互不溶。uu 固定相固定相由层析介质组成，可以是固体或液体。由层析介质组成，可以是固体或液体。 这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解于交换作用，这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解于交换作用，对层析的分离效果起关键作用。对层析的分离效果起关键作用。uu 流动相流动相只在层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一定方向移只在层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一定方向移动的液体或气体。柱层析中流动相一般被称为洗脱剂动的液体或气体。柱层析中流动相一般被称为洗脱剂。它也是层析中的它也是层析中的重要影响因素之一。重要影响因素之一。层析法的特点：层析法的特点： 具有高分辨效力具有高分辨效力 具有高分析效率具有高分析效率 具有高灵敏度具有高灵敏度 应用广泛应用广泛 局限性：局限性：局限性：局限性： 在定量分析中需要纯制的标准物质在定量分析中需要纯制的标准物质 不能精确地解决物质的化学结构问题不能精确地解决物质的化学结构问题实验原理（1 1）常用的层析方法：常用的层析方法：（2 2）本实验要求用）本实验要求用Sephadex G-25 Sephadex G-25 凝胶层析柱将血红凝胶层析柱将血红蛋白与核黄素的混合液分离，并测出洗脱曲线。蛋白与核黄素的混合液分离，并测出洗脱曲线。常用的层析方法常用的层析方法凝胶层析凝胶层析凝胶层析凝胶层析离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析吸附层析分配层析血红蛋白与核黄素 血红蛋白血红蛋白 结构结构 ：血红蛋白（：血红蛋白（HbHb）是由两对珠蛋白）是由两对珠蛋白肽链和肽链和 4 4 个亚铁血红素构成。珠蛋白个亚铁血红素构成。珠蛋白 4 4条肽链（条肽链（ 、 链）；亚铁血红素：原卟链）；亚铁血红素：原卟啉、铁。啉、铁。 特点特点 ：（：（1 1）正常情况下，）正常情况下，99%Hb99%Hb为还为还原原HbHb（HbAHbA），），1%1%为高铁为高铁HbHb（HbFHbF）。）。（2 2）只有）只有Fe2+Fe2+状态的状态的HbHb才能与氧结合，才能与氧结合，称为氧和血红蛋白。（称为氧和血红蛋白。（3 3）在人体生长不）在人体生长不同时期，同时期，HbHb的种类与比例不同。出生后的种类与比例不同。出生后3 3个月，个月，HbA95%HbA95%，而，而HbFHbF降至降至1%1%以下。以下。（4 4）血红蛋白合成受激素（红细胞生成）血红蛋白合成受激素（红细胞生成素、雄激素）调节。（素、雄激素）调节。（5 5）相对分子质量）相对分子质量为为6445864458。（。（6 6）降解产物为珠蛋白、血）降解产物为珠蛋白、血红素。红素。 核黄素核黄素 维生素维生素B2B2，又称核黄素，维他命，又称核黄素，维他命B2B2。它。它是人体必需的是人体必需的1313种维生素之一，作为维种维生素之一，作为维生素生素B B族的成员之一，微溶于水，可溶于族的成员之一，微溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液。氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液。维生素维生素B2B2是机体中许多酶系统的重要辅是机体中许多酶系统的重要辅基的组成成分，参与物质和能量代谢。基的组成成分，参与物质和能量代谢。 分子式：分子式：分子式：分子式： C17H20N4O6 C17H20N4O6 分子量：分子量：分子量：分子量： 376.37 376.37 熔点：熔点：熔点：熔点： 290 290 水溶性：水溶性：水溶性：水溶性： 0.07 g/L (20 0.07 g/L (20) ) 比旋光度：比旋光度：比旋光度：比旋光度： -135 -135 凝胶层析定义定义定义定义凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按凝胶层析是按凝胶层析是按凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术照蛋白质分子量大小进行分离的技术照蛋白质分子量大小进行分离的技术照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或又称之凝胶过滤，分子筛层析或又称之凝胶过滤，分子筛层析或又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析排阻层析排阻层析排阻层析 . .原理原理原理原理 凝胶层析柱中装填着许多之间小于凝胶层析柱中装填着许多之间小于凝胶层析柱中装填着许多之间小于凝胶层析柱中装填着许多之间小于1mm1mm的凝胶颗粒，颗粒内部是呈的凝胶颗粒，颗粒内部是呈的凝胶颗粒，颗粒内部是呈的凝胶颗粒，颗粒内部是呈三维多孔网状结构。在洗脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物三维多孔网状结构。在洗脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物三维多孔网状结构。在洗脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物三维多孔网状结构。在洗脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因直径大于凝胶网孔的孔径而不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着颗粒质因直径大于凝胶网孔的孔径而不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着颗粒质因直径大于凝胶网孔的孔径而不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着颗粒质因直径大于凝胶网孔的孔径而不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先出层析柱的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先出层析柱的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先出层析柱的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先出层析柱; ;小分子组分由于小分子组分由于小分子组分由于小分子组分由于其分子直径小于网状结构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动其分子直径小于网状结构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动其分子直径小于网状结构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动其分子直径小于网状结构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速度慢，比大分子物质后流出层析柱。因此，速度慢，比大分子物质后流出层析柱。因此，速度慢，比大分子物质后流出层析柱。因此，速度慢，比大分子物质后流出层析柱。因此，大的蛋白质直接通过凝胶大的蛋白质直接通过凝胶大的蛋白质直接通过凝胶大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来，分子大小不同的混合物得以分离。珠之间的缝隙首先被洗脱下来，分子大小不同的混合物得以分离。珠之间的缝隙首先被洗脱下来，分子大小不同的混合物得以分离。珠之间的缝隙首先被洗脱下来，分子大小不同的混合物得以分离。凝胶凝胶凝胶凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。 凝凝胶胶层层析析示示意意图图交联葡萄糖凝胶 商品名为Sephadex，是最传统的凝胶介质，由葡萄糖与3-氯-1,2环氧丙烷（交联剂)相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。由于交联度不同，Sephadex颗粒孔隙大小不同。交联度可用“吸水量”表示。即每克干凝胶所吸收的水分质量。商品凝胶的型号采用“吸水量”的10倍数字来表示。例如每克凝胶吸水量为即定为G-25型。常用的葡萄糖凝胶有G-25,G-50,G-100,G-150和G-200几种型号。葡萄糖凝胶最大的缺点是机械强度不高，凝胶颗粒易变形，分辨率不高。但葡萄糖凝胶的价格最低。Sephadex G-25凝胶层析凝胶层析实验器材与试剂（一）器材（一）器材1.2cm x 40cm1.2cm x 40cm层析柱、层析柱、1ml1ml微量可调式微量可调式移液器、移液器、721E721E型分光光度计、恒型分光光度计、恒压贮液瓶、自动部分收压贮液瓶、自动部分收集器集器（二）试剂（二）试剂（1 1）葡聚糖凝胶）葡聚糖凝胶Sephadex G-25.Sephadex G-25. (2) (2)血红蛋白与核黄素血红蛋白与核黄素的混合液。的混合液。（3 3）洗脱液：磷酸盐）洗脱液：磷酸盐缓冲液（）或生理盐水缓冲液（）或生理盐水柱层析的基本装置示意图高位贮液瓶：存储洗脱液，提高位贮液瓶：存储洗脱液，提供液体流动的动力。供液体流动的动力。层析柱：层析分离的核心，根据层析柱：层析分离的核心，根据分离原理与需要可选用不同规格分离原理与需要可选用不同规格的层析柱。的层析柱。检测器：对洗脱流出的样品进行检测器：对洗脱流出的样品进行实时检测，实验室常用检测器就实时检测，实验室常用检测器就是紫外线检测器。是紫外线检测器。记录仪：实时记录检测器的检测记录仪：实时记录检测器的检测结果。结果。部分收集器：自动分部收集各组分部分收集器：自动分部收集各组分实验操作l（1）凝胶处理。将sephadex g-25凝胶干粉放入过量水中浸泡24h或沸水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反复多次。l（2）层析柱的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使用毛刷，以免擦伤层析柱子内壁，影响层析分离效果。固定好层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密封性。将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口的聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡，待气泡排出后，使溶液在底部留至35cm高既可关闭出水口。l（3）装柱。 将处理好的凝胶在烧杯内用1倍提及的洗脱液搅拌成悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至5cm左右时，缓缓打开低端出口管，随之继续缓慢添加凝胶悬浮液直至凝胶体积沉积至25cm高度为止。操作中注意防止气泡与节痕产生。（4 4）平衡。）平衡。 装好后，使层析床稳定装好后，使层析床稳定510min,510min,然后然后接上高位贮液瓶，打开出口活塞，调节高位贮液瓶的接上高位贮液瓶，打开出口活塞，调节高位贮液瓶的高度，控制流速为高度，控制流速为1ml/min1ml/min。用。用2 2倍于床体积的洗脱倍于床体积的洗脱液进行平衡，使层析床稳定液进行平衡，使层析床稳定. .操作过程中应特别注意操作过程中应特别注意：在平衡与洗脱时要将高位在平衡与洗脱时要将高位贮液瓶至层析柱的连接管内的气泡全部排出，以免影贮液瓶至层析柱的连接管内的气泡全部排出，以免影响流速响流速；恒压高位贮液瓶内玻璃管底端出口高度之恒压高位贮液瓶内玻璃管底端出口高度之差不能大于差不能大于40cm40cm，以免影响流速，以免影响流速；平衡过程中务平衡过程中务必防止层析床液体流干必防止层析床液体流干。防止层析床液体流干最简单防止层析床液体流干最简单的方法是使连接高位贮液瓶与层析柱之间的导管形成的方法是使连接高位贮液瓶与层析柱之间的导管形成U U形，形，U U形管底部低于层析柱的出口形管底部低于层析柱的出口；如果需要温如果需要温度平衡，可同时在层析柱夹套内通入恒温水度平衡，可同时在层析柱夹套内通入恒温水。v（5）加样与洗脱。 打开平衡好的层析柱低端出口，使柱内溶液流向与床表面相切时关闭出口。将吸有样品的加样滴灌在床表面上1mm处沿管内壁轻轻转动加样，加完后，打开底端出口使样品流至床表面，关闭出口，用少量洗脱液同样小心清洗管内壁12次，使样品流至床表面，然后加洗脱液加至距床表面23cm高，接上高位贮液瓶并调好流速即开始洗脱。注意在加样和洗脱过程中应缓慢加入液体，防止冲坏床表面，影响分辨率。v（6）收集与测定。 收集时可使用自动部分收集器或手工操作，每管接洗脱液3ml.直至第二个洗脱峰降至基线附近。收集后用721E型分光光度计在451nm波长处以洗脱液为空白，对每管收集液进行光吸收测定。以收集管数（或洗脱体积）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线。注 市售凝胶如需彻底处理，可在溶胀后再用溶液在室温中浸泡半小时，但注意必须避免在酸或碱中加热。另外，用过的凝胶柱如需再生，可用洗涤以去掉堵住网孔的杂质，然后用蒸馏水洗至中性备有。一般使用几次后就需要再生了。