第五章第五章 代谢物酶法分析技术代谢物酶法分析技术江江苏大学大学郑铁生生全国高等医全国高等医药院校医学院校医学检验专业规划教材划教材临床生物化学床生物化学检验 （第二版）（第二版）.第五章江苏大学郑铁生全国高等医药院校医学检验专业教学目教学目标与要求与要求v掌握：掌握：代谢物酶法分析技术的概念，单酶反应直接法、代谢物酶法分析技术的概念，单酶反应直接法、酶促偶联法等方法的设计原理，脱氢酶和过氧化物酶指示酶促偶联法等方法的设计原理，脱氢酶和过氧化物酶指示系统的应用原理，以及平衡法和速率法的设计要求。系统的应用原理，以及平衡法和速率法的设计要求。v熟悉：熟悉：代谢物酶法分析技术的理论基础，酶循环法、酶代谢物酶法分析技术的理论基础，酶循环法、酶活性恢复法、激活剂和抑制剂测定法的设计原理，平衡法活性恢复法、激活剂和抑制剂测定法的设计原理，平衡法和速率法的优缺点。和速率法的优缺点。v了解：了解：试剂酶的质量要求，以及代谢物酶法分析技术的试剂酶的质量要求，以及代谢物酶法分析技术的发展前景。发展前景。.2教学目标与要求掌握：代谢物酶法分析技术的概念，单酶反应直接法代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。定人体內的代谢物或代谢产物的技术。 酶法分析（酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶促）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。酶促反应测定酶活性的一类方法。 代谢物酶法分析技术的概念代谢物酶法分析技术的概念.3代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或目录目录 代谢物酶法分析的理论基础代谢物酶法分析的理论基础1代谢物酶法分析的方法代谢物酶法分析的方法 2代谢物酶法分析的设计要求代谢物酶法分析的设计要求 3小结与展望小结与展望4返回返回总目目录.4目录代谢物酶法分析的理论基础1代谢物酶法分析的方法2 代谢物酶法分析代谢物酶法分析 平衡法（终点法）平衡法（终点法） 速率法（动力学法）速率法（动力学法） 代谢物酶法分析的理论基础代谢物酶法分析的理论基础1.5代谢物酶法分析平衡法（终点法）代谢物酶法分析的理论平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%5%）时，指示）时，指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法为终点法( (end-point method) )。 平衡法的特点是测定底物的总变化量，平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是即测定的是“浓度浓度”。平衡法基本理论平衡法基本理论(1).6平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩积分得积分得： 米氏方程米氏方程 改写为改写为 式中式中 S0 为待测物，为待测物， St 为为待测物至反应待测物至反应t时间后的浓度。时间后的浓度。平衡法基本理论平衡法基本理论(1).7积分得：米氏方程改写为式中S0为待测物，St为若反若反应达到平衡，假达到平衡，假设 ，即，即 S0St S0 ， 以上积分式以上积分式： 则可简化为：则可简化为：l说明达到平衡所需的时间与说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax、 S0 有关，有关，Km越小、越小、Vmax越大（加入酶量越多）、越大（加入酶量越多）、 S0 越小（待越小（待测物越少）则达到平衡所需的时间越短。测物越少）则达到平衡所需的时间越短。平衡法基本理论平衡法基本理论(1).8若反应达到平衡，假设，即S0St若若 S0 Km 积分得：积分得： 可简化为：可简化为： 若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标准若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标准管与测定管反应时间（管与测定管反应时间（t）一致，则有：）一致，则有：平衡法基本理论平衡法基本理论(1).9若S0Km积分得：可简化为：若同时做标准管 标准标准管的管的 S0St 与待测管的与待测管的 S0St 分别代表消分别代表消耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来表示（表示（As和和Au）。标准管的）。标准管的S0与测定管的与测定管的S0分别表示分别表示为为Cs和和Cu。可简化为：可简化为： 平衡法基本理论平衡法基本理论(1).10标准管的S0St与待测管的S0St当当 S0St S0，即反应基本达到平衡，即反应基本达到平衡，Au和和As基基本稳定不变，此时测定误差最小。如果存在基质本稳定不变，此时测定误差最小。如果存在基质效应，效应，两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差。两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差。此式是平衡法测定代谢物的基本原理此式是平衡法测定代谢物的基本原理此公式成立是前提条件此公式成立是前提条件平衡法基本理论平衡法基本理论(1).11当S0StS0，即反应基本达到平衡，A速率法速率法( (rate assay) )又称动力学法、连续监测法，测又称动力学法、连续监测法，测定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的消耗量较小时消耗量较小时( (5%) )，酶促反应呈一级反应，此时的，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。与代测物的浓度成正比例。速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。 速率法基本理论速率法基本理论(2).12速率法(rateassay)又称动力学法、连续监测法，测定根据米氏方程：根据米氏方程： v当当 S Km，则，则 S + Km Kmv当酶量固定不变时，酶促反应的当酶量固定不变时，酶促反应的 最大速度最大速度Vmax也不变也不变符合一级酶促反应符合一级酶促反应米氏方程改为：米氏方程改为： 速率法基本理论速率法基本理论(2).13根据米氏方程：当SKm，则S+Km若同时带标准管，则有若同时带标准管，则有：标准管的标准管的 S0 与测定管的与测定管的 S0 分别表示为分别表示为Cs和和Cu，速度用速度用 A/min来表示。上式改写为：来表示。上式改写为：速率法测定代谢物浓度的原理速率法测定代谢物浓度的原理 前提条件是测定初速度。越偏离初速度，测定误差则越大。前提条件是测定初速度。越偏离初速度，测定误差则越大。速率法基本理论速率法基本理论(2).14若同时带标准管，则有：标准管的S0与测定管的S0分别在临床操作中，只要测定期间待测物消耗在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 5%，只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固定时间法定时间法( (fixed assay) )。 速率法基本理论速率法基本理论(2).15在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 Km2，这时的酶促反应动力学可按单底，这时的酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应动力学。动力学。 但在以但在以NADH 或或NADPH 为底物的终点法测定中，为底物的终点法测定中，因因340 nm 吸光度吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。的限制，辅酶的用量不可能过高。 .20双底物反应直接测定法对于双底物反应，为了便于实验分析，在实在在340 nm 处测定吸光度的处测定吸光度的增加来进行定量的方法增加来进行定量的方法乳酸测定乳酸测定双底物反应直接测定法双底物反应直接测定法 乳酸乳酸 + NAD+丙酮酸 +NADH+H+丙酮酸测定丙酮酸测定 在在340 nm 处测定吸处测定吸光度的下降来进行定量的方法光度的下降来进行定量的方法 乳酸乳酸 + NAD+丙酮酸 +NADH+H+.21在340nm处测定吸光度的增加来进行定量的方法乳酸测定双酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。测目的的方法称酶促偶联法。 最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。 酶偶联法酶偶联法(2).22酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 氧化型辅酶氧化型辅酶NAD(P)+在在340 nm 处没有吸处没有吸收峰收峰, 还原型辅酶还原型辅酶NAD(P)H在在340 nm 处有吸收峰处有吸收峰.23脱氢酶指示系统氧化型辅酶NAD(P)+.23脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶( (NAD+) ) 或氧化型辅酶或氧化型辅酶( (NADP+) )变为还原型变为还原型NAD(P)H后在后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD( (P) )H 变为氧化型变为氧化型NAD( (P) )+，测定，测定340 nm 处吸处吸光度的下降来计算被测物的浓度。光度的下降来计算被测物的浓度。 .24脱氢酶指示系统以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶(脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 血清葡萄糖己糖激酶法测定血清葡萄糖己糖激酶法测定 Glu+ATPG-6-P+ADPG-6-P+NADP+P-6-GA+NADPH + H+指示酶反应将指示酶反应将NADP+转化为转化为NADPH + H+，测定，测定340 nm吸光度上升的吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比速度与葡萄糖的含量成正比 .25脱氢酶指示系统血清葡萄糖己糖激酶法测定Glu+ATP脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 血清尿素测定血清尿素测定 尿素尿素 + H2O2NH3 + CO2NH3 + -酮戊二酸酮戊二酸 + NADH + H+谷氨酸谷氨酸 + H2O + NAD+测定测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定 .26脱氢酶指示系统血清尿素测定尿素+H2O2NH3+常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示系统。系统。脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 .27常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶过氧化物酶指示系统过氧化物酶指示系统 共用的指示反应共用的指示反应最早由最早由Trinder氏氏等人提出，被称等人提出，被称为为Trinder反应反应 最大吸收峰为最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。，在可见光范围内比色。已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目的测定三酯等项目的测定 .28过氧化物酶指示系统共用的指示反应最早由Trinder氏等人过氧化物酶指示系统过氧化物酶指示系统 血清总胆固醇氧化酶测定法血清总胆固醇氧化酶测定法 胆固醇酯胆固醇酯 + H2O胆固醇胆固醇 + O2胆固醇胆固醇 + 脂肪酸脂肪酸4-胆甾烯酮胆甾烯酮 + H2O2红色醌类化合物红色醌类化合物H2O2 + 4-AAP + 酚酚指示酶反应生成的红色醌类指示酶反应生成的红色醌类化合物可在化合物可在500 nm 处比色测定处比色测定 .29过氧化物酶指示系统血清总胆固醇氧化酶测定法胆固醇酯+化学名化学名英文英文缩写写最大吸收峰最大吸收峰（nm）酚酚2，4-二二氯酚酚N-乙基乙基-N-（3-甲苯）甲苯）-N-乙乙酰乙二胺乙二胺N-乙基乙基-N-（2-羟基基-3-丙磺丙磺酰）间甲苯胺甲苯胺N-乙基乙基-N-（3-丙磺丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585过氧化物酶指示系统过氧化物酶指示系统 常用的常用的Trinder反应生色基团反应生色基团 表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶血等色素干扰。血等色素干扰。 .30化学名英文缩写最大吸收峰（nm）酚P500过氧化物酶指示系统利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。达到高灵敏度和特异的要求。 酶循环法酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定的灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶试剂酶( Ea 和和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的的量。该法测定中所选择酶的Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。 酶循环法酶循环法(3).31利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生或其衍生物物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。或靶物质的氧化产物作为底物循环。检测指示系统：检测指示系统： 循环前、后用速率法测定循环前、后用速率法测定NADH( (340 nm) ) 的变化。的变化。检测产物检测产物H2O2可通过可通过Trinder 反应比色测定。反应比色测定。产物循环氧化酶脱氢酶系统产物循环氧化酶脱氢酶系统 .32使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到产物循环氧化酶脱氢酶系统产物循环氧化酶脱氢酶系统 甘油浓度测定 通过通过GPO和和G-3PDH使使G-3P 与与DHAP之间循环，在反复之间循环，在反复循环中循环中G-3P 和和DHAP 的量不变，而产物的量不变，而产物H2O2 随每次循环随每次循环不断递增，同时不断递增，同时NADH 递减。在规定时间递减。在规定时间t 内，内，H2O2 累计累计的量决定于的量决定于t 和每和每min循环次数。循环次数。 .33产物循环氧化酶脱氢酶系统甘油浓度测定通过GPO和G-底物循环脱氢酶辅酶系统底物循环脱氢酶辅酶系统用一种脱氢酶和两种辅酶用一种脱氢酶和两种辅酶( thio-NAD+ 和和NADH)。用用395 nm 415 nm 波长测定反应中氧化型波长测定反应中氧化型thio-NAD+ 转为还原型转为还原型thio-NADH的增加的增加速度。速度。循循环反应条件：环反应条件： 酶对酶对thio-NAD+ 和和NADH应有高度亲和力。应有高度亲和力。溶液溶液pH 和缓冲体系同时有利于双向反应。和缓冲体系同时有利于双向反应。thio-NAD+ 和和NADH 二者的浓度和配比达最适条件。二者的浓度和配比达最适条件。 .34底物循环脱氢酶辅酶系统用一种脱氢酶和两种辅酶(thio底物循环脱氢酶辅酶系统底物循环脱氢酶辅酶系统血淸胆汁酸测定血淸胆汁酸测定 胆汁酸与胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶还原型辅酶（黄色），控制好条件，反应速度与代测（黄色），控制好条件，反应速度与代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。 .35底物循环脱氢酶辅酶系统血淸胆汁酸测定胆汁酸与3-酮氨循环合成酶脱氢酶系统氨循环合成酶脱氢酶系统 NH4+在在NAD合成酶和合成酶和Mg2+存在下催化脱氨存在下催化脱氨-NAD转转化为化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和NH4+同时生成同时生成NADH，生成的，生成的NH4+进入循环再次生成进入循环再次生成NADH，在，在340nm测定。测定。 .36氨循环合成酶脱氢酶系统NH4+在NAD合成酶和Mg2+酶循环法具有的特点酶循环法具有的特点 灵敏度随反应时间的延长而提高灵敏度随反应时间的延长而提高灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高利用酶对底物的特异性利用酶对底物的特异性,使测定系统简化使测定系统简化利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定 .37酶循环法具有的特点灵敏度随反应时间的延长而提高.37酶活性恢复法酶活性恢复法 很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量。微量元素或辅酶的含量。 其他酶法其他酶法(4).38酶活性恢复法很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子 酶活性恢复法酶活性恢复法异柠檬酸异柠檬酸+ NADP+-酮成二酸酮成二酸 + CO2 + NADPH+H+用用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA) 抑制钙离抑制钙离子，标本中子，标本中Mg2+通过恢复通过恢复ICD 活性，催化异柠檬酸脱氢的活性，催化异柠檬酸脱氢的正向反应，使正向反应，使NADP+还原，与镁标准一起在还原，与镁标准一起在340nm测定吸测定吸光度的増加。光度的増加。 .39异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子酶活性恢复法异柠檬酸+NA酶活性恢复法应用举例酶活性恢复法应用举例丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子-半乳糖苷酶法测定钠离子半乳糖苷酶法测定钠离子淀粉酶法测定氯离子淀粉酶法测定氯离子超氧化物歧化酶法测定铜离子超氧化物歧化酶法测定铜离子碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等 .40酶活性恢复法应用举例丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子.40激活和抑制法激活和抑制法 有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在酯酶与标本在37水浴水浴10min，测定剩余的乙酰胆碱，测定剩余的乙酰胆碱酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计算出标本中有机磷的含量。算出标本中有机磷的含量。有机磷的酶法测定有机磷的酶法测定根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。另有抑制另有抑制ALP法测定茶碱、激活法测定茶碱、激活HK法测定镁离子等。法测定镁离子等。返回章目返回章目录.41激活和抑制法有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯试剂酶质量试剂酶质量试剂酶概念试剂酶概念 试剂酶特征试剂酶特征 试剂酶纯度试剂酶纯度酶法设计要求酶法设计要求 酶法设计共性要求酶法设计共性要求 平衡法设计的要求平衡法设计的要求 速率法设计的要求速率法设计的要求 代谢物酶法分析的设计要求代谢物酶法分析的设计要求 3试剂酶来源试剂酶来源.42试剂酶质量试剂酶概念试剂酶特征试剂酶纯度酶法设计要求酶试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的质量是酶试剂质量的决定性因素。质量是酶试剂质量的决定性因素。试剂酶的质量要求试剂酶的质量要求(1)试剂酶的概念试剂酶的概念.43试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量少且价格低廉。少且价格低廉。 不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最适、最适pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。抑制剂对酶活性的影响。 试剂酶的来源和理化特征试剂酶的来源和理化特征试剂酶的质量要求试剂酶的质量要求(1).44主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以以NAD(P)H为指示反应中，要求试剂酶有较高的为指示反应中，要求试剂酶有较高的纯度。而在纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。反应中要求相对低一些。 纯度主要指标纯度主要指标 酶的比活性，酶的比活性越高，酶的比活性，酶的比活性越高，酶的纯度越高。酶的纯度越高。杂酶含量，容易引起副反应的一杂酶含量，容易引起副反应的一些酶含量按些酶含量按 “允许限度允许限度”的要求（见表的要求（见表5-2）。）。 试剂酶的质量要求试剂酶的质量要求(1)试剂酶的纯度要求试剂酶的纯度要求.45不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以NAD(P)H表表5-2常用试剂酶的理化特征及质量要求常用试剂酶的理化特征及质量要求 名称来源分子量等电点比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性的%（允许限度）葡萄糖氧化酶（GOD）A.nigerp.notatum186 000152 0004.3020蔗糖酶含量0.01%,过氧化氢酶10U/mg蛋白己糖激酶(HK)酵母105 0004.50-4.80140磷酸葡萄糖异构酶0.01%,G-6-P脱氢酶0.01%葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)酵母212 0004.50140己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶0.02%过氧化物酶(POD)辣根40 2007.2050不含胺氧化酶及过氧化氢酶.46表5-2常用试剂酶的理化特征及质量要求名称来源分子量等电点名称来源分子量等电点比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性的%（允许限度）脲酶巨豆4830004.905-100天冬氨酸酶0.02%,精氨酸酶0.002%,NH4+0.0005g/U,谷氨酸脱氢酶(GLDH)变形杆菌3000004.6090醇脱氢酶、乳酶脱氢酶、苹果酸脱氢酶0.01%乳酸脱氢酶心1350004.5-4.8 500丙氨酸转氨酶0.01%,丙酮酸激酶、醛缩酶0.001%脂蛋白脂肪酶（LPL）心，假单胞菌属470005.950.05100ATP酶0.00008%,NADH氧化酶0.001%,胆固醇氧化酶0.002%,过氧化氢酶0.02%甘油激酶（GK)嗜热脂肪芽胞杆菌20900085NADH氧化酶0.01%,己糖激酶0.02%.47名称来源分子量等电点比活性杂酶占试剂酶活性的%（允许限度）脲名称来源分子量等电点比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性的%（允许限度）磷酸-3-甘油氧化酶足球菌760004.60.140乳酸氧化酶0.001%胆固醇酯酶(CEH)假单胞菌30200025ATP酶0.00008,NADH氧化酶0.001%,GOD0.00001%,尿酸酶0.00004%,过氧化氢酶1U/mg胆固醇氧化酶(CHOD)链霉菌340005.1-5.425CEH0.005%,GOD0.00014%尿酸酶0.0004%胆红素氧化酶(BOD)疣胞漆斑菌520004.100.2NADH氧化酶0.0007%尿酸酶肝1000006.3015过氧化氢酶1.0%丙酮酸氧化酶2600004.301.5ATP酶0.05%，ALT、AST0.05%.48名称来源分子量等电点比活性杂酶占试剂酶活性的%磷酸-3-甘油所用试剂酶的特异性：指示酶要有更高特异性；所用试剂酶的特异性：指示酶要有更高特异性； 怎样消除干扰因素：加消除剂、抑制剂和用双试剂法；怎样消除干扰因素：加消除剂、抑制剂和用双试剂法；试剂中的附加剂：应不抑制酶的活性，不影响试剂的稳试剂中的附加剂：应不抑制酶的活性，不影响试剂的稳定性，不与底物和体液中的物质作用；定性，不与底物和体液中的物质作用；如何提高灵敏度：如何提高灵敏度：用用PMS或黄递酶，将或黄递酶，将NADH上的氢上的氢交给四氮唑盐，在可见光监测；交给四氮唑盐，在可见光监测； 用酶循环法；用酶循环法； 测定荧测定荧光法。光法。酶法分析的设计要求酶法分析的设计要求(2)酶法设计的共性要求酶法设计的共性要求.49所用试剂酶的特异性：指示酶要有更高特异性；酶法分析的设计要酶的用量要足够大，能使反应酶的用量要足够大，能使反应1 min3 min 达到平衡，达到平衡，以保证较快完成测定。以保证较快完成测定。反应要朝正反应方向进行，如果反应的平衡常数太低，反应要朝正反应方向进行，如果反应的平衡常数太低，可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应pH 等方法等方法,并设标准管一起到达平衡以后测定。并设标准管一起到达平衡以后测定。 Km 在保证测定线性的前提下要尽量小。在保证测定线性的前提下要尽量小。平衡法设计的要求平衡法设计的要求酶法分析的设计要求酶法分析的设计要求(2).50酶的用量要足够大，能使反应1min3min达到平衡，所用酶的所用酶的 Km 应足够大，以保证测定线性和较长的反应足够大，以保证测定线性和较长的反应动态期。应动态期。Km 太小，可加入竞争性抑制剂加大太小，可加入竞争性抑制剂加大 Km。酶用量要合适，用少了可能导致线性期缩短，甚至一酶用量要合适，用少了可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。一般认为酶用量比平衡法小。级反应丧失。一般认为酶用量比平衡法小。速率法酶促反应受很多因素影响，只有很好控制反应速率法酶促反应受很多因素影响，只有很好控制反应速度（速度（v）才与代测物的浓度成正比例。）才与代测物的浓度成正比例。速率法设计的要求速率法设计的要求酶法分析的设计要求酶法分析的设计要求(2).51所用酶的Km应足够大，以保证测定线性和较长的反应动态期。区别区别速率法速率法平衡法平衡法测定定时间检测速度速度检测成本成本产物堆物堆积样品色原品色原测定定仪器器较短短较快快酶酶用量小，成本低用量小，成本低影响影响较小小影响影响较小小要求要求电噪声小，噪声小，A读准到准到0.0001，温差，温差0.1%较长较慢慢酶酶用量大，成本用量大，成本高高影响影响较大大影响影响较大大要求不要求不严 速率法和平衡法测定比较速率法和平衡法测定比较另外，平衡法的试剂酶活性下降对测定影响远没有速率另外，平衡法的试剂酶活性下降对测定影响远没有速率法明显，仅使达到平衡所需时间延长，检测范围变窄。但对法明显，仅使达到平衡所需时间延长，检测范围变窄。但对速率法是致命的，可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。速率法是致命的，可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。由于以上种种原因，代谢物酶法分析大多选择平衡法。由于以上种种原因，代谢物酶法分析大多选择平衡法。 返回章目返回章目录.52区别速率法平衡法测定时间较短较长速率法和平衡法【小结】【小结】4v酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及酶促反应测定酶活性的一辅基、激活剂或抑制剂，以及酶促反应测定酶活性的一类方法。代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来类方法。代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。分为平衡法和测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。分为平衡法和速率法。速率法。v平衡法测定的是底物的总变化量，即平衡法测定的是底物的总变化量，即 “浓度浓度”, 关键关键是要确定达到平衡所需的时间。速率法测定的是速度，是要确定达到平衡所需的时间。速率法测定的是速度，关键是如何使酶促反应成一级反应。关键是如何使酶促反应成一级反应。.53【小结】4酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基【小结】【小结】4v代谢物酶法分析技术可以分为：单酶反应直接法、酶代谢物酶法分析技术可以分为：单酶反应直接法、酶促偶联法、酶循环法、酶活性恢复法、激活剂和抑制剂促偶联法、酶循环法、酶活性恢复法、激活剂和抑制剂测定法等。最常用的偶联指示系统有脱氢酶和过氧化物测定法等。最常用的偶联指示系统有脱氢酶和过氧化物酶指示系统。酶指示系统。v代谢物酶法分析具有许多优点，但测定的影响因素也代谢物酶法分析具有许多优点，但测定的影响因素也不少，因此，在方法设计中要注意试剂酶的特异性和纯不少，因此，在方法设计中要注意试剂酶的特异性和纯度，要注意干扰的避免和灵敏度的提高，速率法和平衡度，要注意干扰的避免和灵敏度的提高，速率法和平衡法的应用要得当等。法的应用要得当等。.54【小结】4代谢物酶法分析技术可以分为：单酶反应直接法、酶促偶【展望】【展望】4近几年来，活力高、杂酶少且价廉的基因重组酶蛋白已近几年来，活力高、杂酶少且价廉的基因重组酶蛋白已经面世，并开始应用于临床生物化学检验；经面世，并开始应用于临床生物化学检验；酶循环法发展潜力很大酶循环法发展潜力很大, 如与其他手段结合可使循环速如与其他手段结合可使循环速度达到度达到 1000 次次/min ，灵敏度可望达到纳摩尔级，可用于，灵敏度可望达到纳摩尔级，可用于甾醇激素的测定；甾醇激素的测定；目前已设计出几百种酶试剂系统和测定方法，用于目前已设计出几百种酶试剂系统和测定方法，用于200多个临床生化检验项目，成为最有发展前途的分析方法。多个临床生化检验项目，成为最有发展前途的分析方法。可以预见将来，现有的分析方法将基本上被酶试剂方法可以预见将来，现有的分析方法将基本上被酶试剂方法所取代，可用于测定人体內所有代谢物及其产物。所取代，可用于测定人体內所有代谢物及其产物。.55【展望】4近几年来，活力高、杂酶少且价廉的基因重组酶蛋白已经返回章目返回章目录.56谢谢！返回章目录.56