毒理学基础实验课毒理学基础实验课鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验Ames test公共卫生学院卫生毒理教研室公共卫生学院卫生毒理教研室高淑英高淑英毒理学基础实验课毒理学基础实验课原原 理理鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌野生型（原养型）野生型（原养型）人工方法正向诱变鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型（异养型）组氨酸缺陷型（异养型）诱变物作用回复突变 AmesAmes是检测遗传毒理学的体外试是检测遗传毒理学的体外试验，检测终点是基因突变验，检测终点是基因突变毒理学基础实验课毒理学基础实验课TA1537TA1538TA1535R R因子因子R R因子因子R R因子因子TA97TA98TA100TA102移码突变移码突变碱基置换突变碱基置换突变移码突变、碱移码突变、碱基置换突变基置换突变实验菌株实验菌株毒理学基础实验课毒理学基础实验课深粗糙深粗糙（rfa）特性特性2紫外线敏感（紫外线敏感（UvrB）特性）特性3抗氨苄青霉素（抗氨苄青霉素（R因子）特性因子）特性4自发回变特性自发回变特性5组氨酸需求特性组氨酸需求特性1菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定毒理学基础实验课毒理学基础实验课1、组氨酸需求特性、组氨酸需求特性有细菌生长有细菌生长空白空白空白空白组氨酸组氨酸- -生物素生物素赖氨酸赖氨酸空白空白37 24h0.1ml0.1ml菌液菌液顶层顶层底层底层菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定毒理学基础实验课毒理学基础实验课2、深粗糙（、深粗糙（rfa）特性）特性0.1ml0.1ml菌液菌液顶层顶层普通培养基普通培养基抑菌环抑菌环滤纸片（有结晶紫）滤纸片（有结晶紫）3724h24h菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定毒理学基础实验课毒理学基础实验课3、紫外线敏感特性、紫外线敏感特性普通培养基普通培养基15W紫外灯紫外灯33cm，8s37，24h菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定毒理学基础实验课毒理学基础实验课4、抗氨卞青霉素（抗氨卞青霉素（R R因子）因子）特性特性37，24h青霉素青霉素普通培养基普通培养基菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定毒理学基础实验课毒理学基础实验课5、自然回变特性、自然回变特性0.1ml0.1ml菌液菌液顶层顶层底层底层37，24h菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定毒理学基础实验课毒理学基础实验课菌株菌株基因型基因型组氨组氨酸缺酸缺陷陷脂多糖脂多糖屏蔽缺屏蔽缺失失抗氨抗氨卞西卞西林林抗四抗四环素环素uvrBuvrB修修复缺复缺陷陷自发回变自发回变（-S9-S9）TA97TA97+ + + +- -+ +90-18090-180TA98TA98+ + + +- -+ +30-5030-50TA100TA100+ + + +- -+ +120-200120-200TA102TA102+ + + +- -+ +240-320240-320AmesAmesAmesAmes试验菌株特性试验菌株特性试验菌株特性试验菌株特性毒理学基础实验课毒理学基础实验课实验设计原则实验设计原则受试物最低剂量为每皿受试物最低剂量为每皿0.1g0.1g一般选用一般选用4545个剂量个剂量 每个剂量应做每个剂量应做2 2或或3 3个平行平皿个平行平皿 设立阳性对照和阴性（溶剂）对照设立阳性对照和阴性（溶剂）对照 受试物最高剂量为每皿受试物最高剂量为每皿5mg5mgAmesAmes试验设计试验设计毒理学基础实验课毒理学基础实验课点试法点试法点试法将顶层培养基倒入底层培养基中，凝将顶层培养基倒入底层培养基中，凝固后放入滤纸片，将受试物点在纸片固后放入滤纸片，将受试物点在纸片上放入底层，上放入底层，3737培养培养48h48h观察结果观察结果掺入法掺入法掺入法掺入法掺入法掺入法将受试物将受试物0.1ml0.1ml、菌液、菌液0.1ml0.1ml分别加入分别加入顶层培养基中，倒入底层培养基中，顶层培养基中，倒入底层培养基中，凝固后凝固后3737培养培养48h48h观察结果观察结果AmesAmes试验方法及结果评价试验方法及结果评价点样纸片周围长出一点样纸片周围长出一圈密集的圈密集的His+His+回变菌回变菌落者，受试物即为阳落者，受试物即为阳性致突变物质。性致突变物质。背景菌生长良好受试物背景菌生长良好受试物每皿回变菌落数增加一每皿回变菌落数增加一倍以上并有剂量倍以上并有剂量- -反应反应关系，试验结果具有重关系，试验结果具有重现性即可认为该受试物现性即可认为该受试物为诱变阳性。为诱变阳性。 毒理学基础实验课毒理学基础实验课S-9S-9混合液的制备过程混合液的制备过程2 25 53 34 41 1暴露肝脏，暴露肝脏，KCLKCL灌注灌注断头处死大鼠、放血、去皮断头处死大鼠、放血、去皮取出肝脏，加入取出肝脏，加入KCLKCL剪碎剪碎制成匀浆，制成匀浆，9000g9000g离心离心取上清、分装、冻存取上清、分装、冻存毒理学基础实验课毒理学基础实验课S-9S-9混合液的组成成分混合液的组成成分肝匀浆肝匀浆S-9 100 l 0.4mol/L MgCl2 20 l1.66mol/LKCl 20 l0.05mol/L 6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 100 l0.025mol/L 辅酶辅酶(NADPH) 160 l0.2mol/L 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 500 l 加灭菌水加灭菌水 至至 1ml毒理学基础实验课毒理学基础实验课安全措施与废弃物处理应有专门的实验室，应有良好的通风设备。应有专门的实验室，应有良好的通风设备。 试验者必须注意个人防护，尽量减少接触污染的机会。试验者必须注意个人防护，尽量减少接触污染的机会。 受试的致癌物与致突变物的废弃处理，原则上按放射性受试的致癌物与致突变物的废弃处理，原则上按放射性核素废弃物处理方法进行。核素废弃物处理方法进行。 所用沙门氏菌试验菌株一般毒性较低，具有所用沙门氏菌试验菌株一般毒性较低，具有R R因子的危害因子的危害更小，但要防止沙门菌污染动物饲养室。更小，但要防止沙门菌污染动物饲养室。毒理学基础实验课毒理学基础实验课制作人：高淑英制作人：高淑英联系电话：联系电话：0451-87502830