天津大学生物化学天津大学生物化学0505第五章第五章课件核酸化学课件核酸化学第一节第一节 核酸的概述核酸的概述1 1染色体和基因染色体和基因2 2核酸核酸第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（核酸的分布）（核酸的分布）第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（核酸的功能）（核酸的功能）DNADNA功能：功能：遗传信息的载体，负责遗遗传信息的载体，负责遗传信息的贮存和发布。传信息的贮存和发布。RNARNA功能：功能：三者共同参与遗传信息的三者共同参与遗传信息的表达表达。 第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（核酸的组成）（核酸的组成）核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖碱基碱基水水解解核蛋白核蛋白蛋白质蛋白质这样看这样看核酸是一核酸是一种高聚核种高聚核苷酸，它苷酸，它的基本结的基本结构单位是构单位是核苷酸核苷酸。第二节第二节 核苷酸核苷酸( (总）总）1 1核糖核糖2 2碱基碱基3 3核苷核苷4 4核苷酸核苷酸5 5多磷核苷酸（多磷核苷酸（ATPATP）核苷核苷核酸核酸核苷酸核苷酸碱基碱基许多个许多个戊糖戊糖磷酸磷酸第二节第二节 核苷酸核苷酸(1(1戊糖）戊糖）组成核酸的戊糖有两种组成核酸的戊糖有两种 组成组成DNADNA 组成组成RNARNA第二节第二节 核苷酸核苷酸(2(2碱基碱基1 1）核酸中的碱基分两类：核酸中的碱基分两类：（1 1）嘧啶碱：）嘧啶碱：胞嘧啶（胞嘧啶（C C） 尿嘧啶（尿嘧啶（U U） 胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）（2 2）嘌呤碱：）嘌呤碱：腺嘌呤（腺嘌呤（A A） 鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶 U U胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶 T T胞嘧啶胞嘧啶胞嘧啶胞嘧啶 C CDNADNA特有特有特有特有RNARNA特有特有特有特有 嘧啶环嘧啶环嘧啶环嘧啶环第二节第二节 核苷酸核苷酸(2(2碱基碱基22嘧啶嘧啶11）第二节第二节 核苷酸核苷酸(2(2碱基碱基22嘧啶嘧啶22）NNHNH2O 胞嘧啶胞嘧啶Cytosine(C)N HNHOO 尿嘧啶尿嘧啶Uracil(U)N HNHOO胸腺嘧啶胸腺嘧啶Thymine(T)注意与书上图画法的区别注意与书上图画法的区别第二节第二节 核苷酸核苷酸(2(2碱基碱基33嘌呤嘌呤11）鸟嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤 G G腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤 A A 嘌呤环嘌呤环嘌呤环嘌呤环第二节第二节 核苷酸核苷酸(2(2碱基碱基33嘌呤嘌呤22）NNNHNNH2腺嘌呤腺嘌呤Adenine(A)N HNNHNONH2鸟嘌呤鸟嘌呤Guanine(G)注意与书上图画法的区别注意与书上图画法的区别第二节第二节 核苷酸核苷酸(3(3核苷核苷1 1）核苷是一种糖苷，由戌糖和碱基缩合而成核苷是一种糖苷，由戌糖和碱基缩合而成糖糖与与碱碱基基之之间间以以糖糖苷苷键键相相连连接接。糖糖的的第第一一位位上上的的碳碳原原子子（C C1 1）与与嘧嘧啶啶碱碱的的第第一一位位上上的的氮氮原原子子（N N1 1）或或嘌嘌呤呤碱碱的的第第九九位位上上的的氮氮原原子子（N N9 9）相相连连，所所以以糖糖与与碱碱基基间间的的连连键键是是N-CN-C键键，一般称之为一般称之为N-N-糖苷键。糖苷键。蛋蛋白白质质与与糖糖连连接接时时，天天冬冬酰酰氨氨的的氨氨基基与与半半羧醛羟基间形成的为羧醛羟基间形成的为N-N-糖苷键糖苷键第二节第二节 核苷酸核苷酸(3(3核苷核苷2 2）糖与碱基之间以糖与碱基之间以C-NC-N糖苷键连接糖苷键连接第二节第二节 核苷酸核苷酸(4(4核苷酸核苷酸1 1）核苷中的戌糖羟基被磷酸酯化，就形成核苷酸核苷中的戌糖羟基被磷酸酯化，就形成核苷酸作作为为DNA或或RNA结结构构单单元元的的核核苷苷酸酸分分别别是是5-磷磷酸酸-脱氧核糖核苷和脱氧核糖核苷和5-磷酸磷酸-核糖核苷核糖核苷第二节第二节 核苷酸核苷酸(4(4核苷酸核苷酸2 2）磷磷酸酸碱碱基基戊糖戊糖第二节第二节 核苷酸核苷酸(4(4核苷酸核苷酸3 3）HH2 2OO碱基碱基磷磷酸酸戊糖戊糖糖苷键脂键第二节第二节 核苷酸核苷酸(4(4核苷酸核苷酸4 4）l lM-M-单单单单(D-(D-(D-(D-二；二；二；二；T T T T三）三）三）三） ；P-P-P-P-磷酸磷酸磷酸磷酸lRNARNA的名称为某（单、二、三）苷酸，的名称为某（单、二、三）苷酸，DNADNA在某在某（单、二、三）前加脱氧两字。（单、二、三）前加脱氧两字。l如如AMPAMP称腺苷称腺苷磷酸磷酸( (或腺苷酸），或腺苷酸），dAMPdAMP称为脱氧称为脱氧腺苷腺苷磷酸（脱氧腺苷酸）磷酸（脱氧腺苷酸）。八种核苷酸如下表所示八种核苷酸如下表所示第二节第二节 核苷酸核苷酸(5(5多磷核苷酸多磷核苷酸1 1）参参与与核核酸酸生生物物合合成成的的直直接接原原料料不不是是一一磷磷酸酸核核苷苷酸酸，而而是是三三磷磷酸酸核核苷苷酸酸，如如ATP ATP （三三磷酸腺苷酸）。磷酸腺苷酸）。ATPATP上的磷酸残基用上的磷酸残基用、来编号。来编号。ATPATP含有两个高能磷酸酯键（含有两个高能磷酸酯键（P P），），其水解时释其水解时释放出的能量为放出的能量为7.37.3千卡千卡/ /克分子（普通磷酸酯键为克分子（普通磷酸酯键为2 2千卡千卡/ /克分子）。克分子）。ATPATP在细胞能量代谢中起着及其重要的作用。在细胞能量代谢中起着及其重要的作用。 第二节第二节 核苷酸核苷酸(5(5多磷核苷酸多磷核苷酸2 2）(腺嘌呤核糖核苷三磷酸腺嘌呤核糖核苷三磷酸)O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷 (ATP)第三节第三节 核酸的结构核酸的结构一、一、DNADNA的结构的结构 二、二、RNARNA的结构的结构 一、一、DNADNA的结构的结构1 1( (总）总）（一）（一）DNADNA的的碱基组成的的碱基组成 （二）（二）DNADNA的一级结构的一级结构 （三）（三）DNADNA的二级结构的二级结构 （四）（四）DNADNA的三级结构的三级结构 （一）（一）DNADNA的碱基组成的碱基组成碱基组成的规律：碱基组成的规律：1 1A=TA=T，G=CG=C A+G=C+T A+G=C+T2 2没有组织和器官的特异性没有组织和器官的特异性3 3具有种的特异性具有种的特异性4 4年年龄龄、营营养养状状态态和和环环境境的的改改变变不不影影响响DNADNA的的碱碱基组成基组成（二）（二）DNADNA的一级结构的一级结构1 1各各核核苷苷酸酸残残基基沿沿多多核核苷苷酸酸链链排排列列的的顺顺序叫核酸的一级结构。序叫核酸的一级结构。连连接接键键：3 3，5 5一一磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接起起来来的直线形或环形分子。的直线形或环形分子。DNADNA没有侧链。没有侧链。脱脱脱脱HH2 2OO脂键相连脂键相连脂键相连脂键相连33，5-5-磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键首首尾尾3553连连接接键键（二）（二）DNADNA的一级结构的一级结构3 3( (线条缩写线条缩写) )DNA线条缩写线条缩写:戊糖戊糖5-磷酸磷酸PA A核苷酸核苷酸53首端首端末端末端PPPPPP A G C T G C A G C T G C OH OH3-OH3-OH 核苷酸顺序又称核苷酸顺序又称碱基顺序碱基顺序，是蛋白质与核，是蛋白质与核酸结构的生物语言。酸结构的生物语言。硷基硷基（二）（二）DNADNA的一级结构的一级结构4 4( (字母简写字母简写) )DNA字母简写字母简写: 5 A P G P C P T P G P C P 3 或或 5 A G C T G C 3（二）（二）DNADNA的二级结构的二级结构1 1( (总总) )1 1DNADNA双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点 2 2双螺旋结构的稳定因素双螺旋结构的稳定因素3 3DNADNA双螺旋的不同类型双螺旋的不同类型 （二）（二）DNADNA的二级结构的二级结构2 2公公认认的的为为19531953年年watsonwatson和和crickcrick提提 出出的的 DNADNA双双 螺螺旋结构模型旋结构模型（二）（二）DNADNA的二级结构的二级结构3 3此模型的建立主要基于两方面的根据此模型的建立主要基于两方面的根据（1 1）碱碱基基组组成成A=TA=T，C=GC=G，并并证证明明A A与与T T之之间间可可生生成成两两个个氢氢键键，而而C C与与G G之之间间三三个个氢键。氢键。（2 2）X X衍衍射射结结构构分分析析：不不同同来来源源的的DNADNA纤维具有相似的纤维具有相似的X X光衍射图谱。光衍射图谱。1 1DNADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点1 1（1 1）（1 1）DNADNA分分子子是是由由两两条条方方向向相相反反的的平平行行的的多多核核苷苷酸酸链链构构成成。即即p5p5- -糖糖3 3-p-p的的结结构构与与p3p3- -糖糖5 5-p-p的的结结构构相相对对; ;两两条条链链的的糖糖磷磷酸酸主主链都是右手螺旋，有一共同的螺旋轴。链都是右手螺旋，有一共同的螺旋轴。1 1DNADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点1 1（2 2）螺螺旋旋表表面面 有有 一一条条 大大 沟沟和和 一一 条条小沟小沟大沟大沟小沟小沟1 1DNADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点2 2（1 1）（2 2）两两条条链链由由碱碱基基间间的的氢氢键键相相连连，碱碱基基对对与与螺螺旋旋轴轴垂垂直直, ,与与糖糖环环平平面面垂垂直直; ;碱碱基基在在糖糖环环的的内内侧侧，磷磷酸酸基基在在糖糖环环的的外外侧侧；相相邻邻碱碱基基对对平平面面间间的的距距离离是是0.34nm0.34nm，相相邻邻核核苷苷酸酸彼彼此此相相差差36360 0，双双螺螺旋旋的的每每转转有有1010对对核核苷苷酸酸，每每转转高高3.4nm3.4nm。1 1DNADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点3 3（3 3）碱基成对有一定的规律：碱基成对有一定的规律： A-TA-T，C-GC-G或或T-AT-A，G-CG-CA A与与T T之间为二个氢键，之间为二个氢键，C C与与G G之间为三个氢键之间为三个氢键双螺旋双螺旋DNADNA分子整个长度的直径相同，为分子整个长度的直径相同，为2nm2nm1 1DNADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点3 3双双螺螺旋旋DNADNA分分 子子整整个个长长度度的的直直径径相相同同 ， 为为2nm2nm1 1DNADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点4 4（4 4）一一个个链链的的碱碱基基顺顺序序确确定定后后，则则另另一一条条链链必必有有相相对对应应的的碱碱基基顺顺序。序。碱碱基基互互补补原原则则具具有有极极重重要要意意义义，DNADNA复复制制、转转录录、反反转转录录等等过过程程的的分分子子基基础础都都是是碱碱基互补配对。基互补配对。2 2双螺旋结构的稳定因素双螺旋结构的稳定因素1 1（1 1）氢键）氢键（2 2）离子键及范德华力）离子键及范德华力（3 3）碱基堆积力）碱基堆积力2 2双螺旋结构的稳定因素双螺旋结构的稳定因素2 2（1 1）氢氢键键：两两条条链链间间碱碱基基的的相相互互作作用用，A A与与T T之之间间为为二二条条氢氢键键，C C与与G G之之间间为为三三条条氢氢键键。氢氢键键作作用用力力很很弱弱，但但DNADNA分子中存在大量氢键，因此氢键为一重要稳定因素。分子中存在大量氢键，因此氢键为一重要稳定因素。（2 2）离离子子键键及及范范德德华华力力：DNADNA分分子子中中磷磷酸酸基基因因在在生生理理条条件件下下解解离离，使使DNADNA成成为为一一种种多多阴阴离离子子，这这有有利利于于它它与与带带正正电电荷荷的的其其它它阳阳离离子子基基团团发发生生静静电电作作用用，这这样样减减少少双双链链间间的的静电排斥，有利于双螺旋的稳定。静电排斥，有利于双螺旋的稳定。（3 3）碱碱基基堆堆积积力力：目目前前普普遍遍认认为为堆堆积积碱碱基基间间的的疏疏水水作作用用是是稳稳定定DNADNA结结构构的的更更重重要要的的因因素素。大大量量碱碱基基层层层层堆堆积积，两两相相邻邻碱碱基基的的平平面面十十分分贴贴近近，于于是是使使双双螺螺旋旋结结构构内内部部形形成成一一个个强强大大的的疏疏水水区区，与与介介质质中中的的小小分分子子隔隔开开，有有利利于于互互补补碱基之间氢键的形成。碱基之间氢键的形成。3 3DNADNA双螺旋的不同类型双螺旋的不同类型1 1B B型型DNADNA（B BDNADNA）: :在在相相对对湿湿度度为为92%92%时时, ,所得到的所得到的DNADNA钠盐纤维。钠盐纤维。A A型型DNADNA（A ADNADNA）: :在在相相对对温温度度低低于于75%75%时，获得的时，获得的DNADNA钠盐纤维。钠盐纤维。此外还有此外还有Z ZDNADNA等。等。3 3DNADNA双螺旋的不同类型双螺旋的不同类型2 2（四）（四）DNADNA的三结构的三结构 当当研研究究某某些些小小病病毒毒、线线粒粒体体、叶叶绿绿体体及及某某些些细细菌菌中中分分离离出出来来降降解解的的DNADNA时时，发发现现它它们们的的双双螺螺旋旋二二级级结结构构还还可可进进一一步步紧紧缩缩成成闭闭链链环环状状或或开开链链环环状状以以及及麻麻花花状状等等，这这是是DNADNA形成的三级结构。形成的三级结构。松弛形松弛形解链环形解链环形负超螺旋负超螺旋二、二、 RNA RNA的分子结构的分子结构1 1（一）（一）RNARNA一级结构一级结构（二）（二）RNARNA的碱基组成的碱基组成（三）（三）RNARNA的类型的类型（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构 （一）（一）RNARNA一级结构一级结构由由几几十十个个至至几几千千个个AMPAMP，GMPGMP，CMPCMP和和UMPUMP四四种种核核苷苷酸酸借借磷磷酸酸二二酯酯键键相相连连的的多多核核苷苷酸酸链链，其其中中不不含含侧链。侧链。 （二）（二）RNARNA的碱基组成的碱基组成含含腺腺嘌嘌呤呤、鸟鸟嘌嘌呤呤、胞胞嘧嘧啶啶、和和尿尿嘧嘧啶啶四四种种碱碱基基，尚尚含含有有多多种种“稀稀有有碱碱基基”和和特特殊殊形式的核苷。形式的核苷。其其中中以以各各种种甲甲基基化化的的碱碱基基和和“假假尿尿嘧嘧啶啶核苷核苷”尤为丰富。尤为丰富。假尿苷假尿苷 这些不寻常的成分可能与这些不寻常的成分可能与tRNAtRNA的生物学功的生物学功能有一定的关系能有一定的关系（三）（三）RNARNA的类型的类型（ rRNA 1 rRNA 1）含量：含量：75-80%75-80%存存在在：与与蛋蛋白白质质结结合合成成核核蛋蛋白白的的形形式式，存存在在于于细胞质的核蛋白体中。细胞质的核蛋白体中。功功能能：以以核核蛋蛋白白体体的的形形式式在在蛋蛋白白质质生生物物合合成成中中提供合适的工作场所。提供合适的工作场所。分分子子量量: :它它的的分分子子量量都都比比较较大大，大大肠肠杆杆菌菌核核糖糖体体中中有有三三类类rRNArRNA（它它们们的的沉沉降降系系数数分分别别为为5S5S、16S16S、23S23S）；动动物物细细胞胞核核糖糖体体rRNArRNA有有四四类类（5S 5S 、 5.8S 5.8S 、 18S18S和和28S28S）。）。（三）（三）RNARNA的类型的类型（ rRNA 2 rRNA 2）大肠杆菌大肠杆菌5SRNA5SRNA的结构的结构（三）（三）RNARNA的类型的类型（tRNAtRNA）含量：含量：约占约占101015%15%存存在在：tRNAtRNA溶溶于于“胞胞液液”部部分分中中，它它们们以以自由状态或以氨基酸结合状态而存在。自由状态或以氨基酸结合状态而存在。分子量：分子量：都较小。都较小。功功能能：蛋蛋白白质质的的生生物物合合成成中中起起选选择择性性运运输输原原料料（氨氨基基酸酸）的的作作用用，因因此此把把tRNAtRNA叫叫受受体体RNA RNA 。（三）（三）RNARNA的类型的类型（mRNA1mRNA1）含量含量: :占总占总RNARNA的的5%5%存存在在：在在细细胞胞核核中中以以DNADNA为为模模板板被被合合成成以以后后，可可能能暂暂存存于于核核仁仁内内，也也可可能能立立即即转转移移到到胞胞质质中中，并并以以每每分分子子mRNAmRNA与与几几个个或或几几十十个个核核蛋蛋白白体体结结合合成成串串珠珠样样的多核蛋白体形式而存在。的多核蛋白体形式而存在。特特点点：一一般般都都很很不不稳稳定定，代代谢谢活活跃跃，更更新新迅迅速速，寿命较短，种类很多。寿命较短，种类很多。功功能能: :在在蛋蛋白白质质生生物物合合成成中中起起传传递递遗遗传传信信息息的的作作用，故也叫信息用，故也叫信息RNARNA（iRNAiRNA）。）。（三）（三）RNARNA的类型的类型（mRNA2mRNA2）顺反子：顺反子： mRNAmRNA上具有翻译功能的核苷酸顺序。上具有翻译功能的核苷酸顺序。polyApolyA片段：片段：指指10-20010-200个多聚腺苷酸，这与个多聚腺苷酸，这与mRNAmRNA顺利通顺利通过核膜进入胞浆有关，也与过核膜进入胞浆有关，也与mRNAmRNA从细胞核转移到核糖从细胞核转移到核糖体的过程有关，也有人认为与病毒侵染性有关。体的过程有关，也有人认为与病毒侵染性有关。 “帽子帽子”结构：结构： 55- -末端的末端的G G被甲基化，通过焦磷酸被甲基化，通过焦磷酸与另一个发生了核糖上甲基化的核苷酸以与另一个发生了核糖上甲基化的核苷酸以55、 5 5- -磷酸二酯键相连磷酸二酯键相连, ,此结构对此结构对mRNAmRNA的翻译活性是重要的。的翻译活性是重要的。 （三）（三）RNARNA的类型的类型（mRNA3mRNA3）（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构1 1( (总总) )（1 1）由四臂四环组成）由四臂四环组成（2 2）叶柄是氨基酸臂）叶柄是氨基酸臂（3 3）有反密码环）有反密码环（4 4）左臂连接（）左臂连接（D D环）环）（5 5）右侧有一个）右侧有一个TCTC环环（6 6）含有修饰碱基）含有修饰碱基tRNAtRNA的三叶草型结构特点（总）的三叶草型结构特点（总）D环反密码环反密码环TCTC环环可变环可变环（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构2 2(1)(1)（ 1 1） tRNAtRNA一一般般由由四四臂臂四四环环组组成成。分分子子由由A-UA-U、G-CG-C碱碱基基对对构构成成的的双双螺螺旋旋区区叫叫做做臂臂；不不能能配配对对部分叫部分叫环。环。叶子叶子臂臂123（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构2 2(2)(2)（2 2）三三叶叶草草的的叶叶柄柄叫叫做做氨氨基基酸酸臂臂，它它包包括括3 3，端端接接受受氨氨基基酸酸的的 部部 位位 CpCpAOHCpCpAOH载运氨基酸载运氨基酸载运氨基酸载运氨基酸（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构2 2(3)(3)（3 3）位位于于氨氨基基酸酸臂臂对对面面的的反反密密码码环环含含有有组组成成该该tRNAtRNA反反密密码码子子的的三三个个核苷酸。核苷酸。反密码子环反密码子环 反密码子反密码子（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构2 2(4)(4)（4 4）左左臂臂连连接接一一个个二二氢氢尿尿嘧嘧啶啶环环（D D环环），环环上上含含有有二二氢氢尿尿嘧啶。嘧啶。D D环环（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构2 2(5)(5)（5 5）右右侧侧有有一一个个T TC C环环（含含有有T T C C顺顺序序，代代表表假假尿尿苷苷）和和一一个个可可变变环环，不不同同tRNAtRNA的的可可变变环环上上核核苷苷酸酸的的数数目变化较大。目变化较大。T TC C（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构2 2(5)(5)（6 6）tRNAtRNA分分子子中中含含有有修修饰饰碱碱基基，但但多多少少不不等等。在在某某些些位位置置上上的的核核苷苷酸酸对对于于所所有有的的tRNAtRNA都都是是同同样样的的，或或变变化化很很少少叫叫做做不变核苷酸。不变核苷酸。稀有碱基稀有碱基（五）（五）RNARNA的三级结构的三级结构1 1tRNAtRNA的三级结构的三级结构: :倒写的倒写的L L字母字母氨基酸的接受端氨基酸的接受端3 3，- -端端-CCA-CCA反密码子反密码子（五）（五）RNARNA的三级结构的三级结构2 2tRNAtRNA的三级结构的三级结构2 2第四节第四节 核酸的提取、分离和测定核酸的提取、分离和测定一、一、RNARNA的分离提取的分离提取二、二、DNADNA的提取和分离的提取和分离 三、核酸含量的测定三、核酸含量的测定 一、一、RNARNA的分离提取的分离提取1 1目目前前最最常常用用的的为为酚酚提提取取法法：即即用用缓缓冲冲液液饱饱和和的的酚溶液酚溶液直接处理组织或细胞，以除去其中的蛋白质和直接处理组织或细胞，以除去其中的蛋白质和DNADNA若若加加入入适适量量十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠或或其其它它去去污污剂剂可可进进一一步步抑抑制制核糖核酸酶，并使蛋白质去除得更加干净。核糖核酸酶，并使蛋白质去除得更加干净。将将得得到到的的RNARNA提提取取液液用用乙乙醇醇反反复复沉沉淀淀数数次次，溶溶解解后后进进行行透析，再冷冻干燥。透析，再冷冻干燥。提提取取不不同同种种类类的的RNARNA时时，也也可可将将各各种种亚亚细细胞胞部部分分事事先先分分开开（因因为为不不同同种种类类的的RNARNA存存在在于于细细胞胞中中的的不不同同部部位位），然然后后分分别别从从核核蛋蛋白白体体中中提提取取rRNArRNA，从从多多核核蛋蛋白白体体中中提提取取mRNAmRNA，从去除这些成分及其它颗粒后的细胞液中提取从去除这些成分及其它颗粒后的细胞液中提取tRNAtRNA。一、一、RNARNA的分离提取的分离提取2 21 1密度梯度离心法密度梯度离心法2 22 2柱层析法柱层析法3 3凝胶电泳法凝胶电泳法一、一、RNARNA的分离提取的分离提取3 3(1)(1)离离心心管管中中放放30% 30% - - 5%5%的的蔗糖溶液。蔗糖溶液。欲欲分分离离RNARNA溶溶液液放放在在蔗蔗糖糖溶液面上。溶液面上。经经高高速速离离心心数数小小时时后后，分分子子大大小小不不同同的的RNARNA即即分分散散于于不不同同密密度度的的蔗蔗糖糖部部位位中。中。应应用用啡啡啶啶溴溴红红氯氯化化铯铯密密度度梯梯度度平平衡衡超超离离心心，可可分分开开不不同同构构象象的的DNADNA、RNARNA和蛋白质。和蛋白质。1 1密度梯度离心法密度梯度离心法1 15蔗糖蔗糖10蔗糖蔗糖20蔗糖蔗糖30蔗糖蔗糖一、一、RNARNA的分离提取的分离提取3 3(2)(2)1 1密度梯度离心法密度梯度离心法2 2石蜡油石蜡油蛋白质蛋白质开环形及开环形及线性线性DNA闭环形质闭环形质粒粒DNARNA用垂直转头用垂直转头6500065000转转6 6h h，角转头角转头4500045000转转3636h h，离心后，蛋白质在最上离心后，蛋白质在最上面，面，RNARNA沉淀在底部，超沉淀在底部，超螺旋螺旋DNADNA沉淀较快，开链沉淀较快，开链或环形或环形DNADNA沉淀较慢。沉淀较慢。此法分离的此法分离的DNADNA纯度较纯度较高，可供高，可供DNADNA重组等实验重组等实验用。如需更纯品，可再用。如需更纯品，可再进行一次氯化铯密度梯进行一次氯化铯密度梯度离心。度离心。一、一、RNARNA的分离提取的分离提取4 42 2柱层析法柱层析法常用的支持体为二乙胺乙基（常用的支持体为二乙胺乙基（DEAEDEAE）纤维纤维素（离子交换），葡聚糖凝胶等（凝胶过滤）素（离子交换），葡聚糖凝胶等（凝胶过滤）因为核酸和核苷酸是两性电解质，在一定因为核酸和核苷酸是两性电解质，在一定的的pHpH值条件下各解离基团的解离情况不同，值条件下各解离基团的解离情况不同，即有与蛋白质相似的等电点（南大即有与蛋白质相似的等电点（南大P147P147）。）。一、一、RNARNA的分离提取的分离提取5 53 3凝胶电泳法凝胶电泳法不同种类的不同种类的RNARNA分子所带电荷与其质量之比分子所带电荷与其质量之比都非常接近，故用一般电泳方法不易分开。都非常接近，故用一般电泳方法不易分开。若以某些凝胶为支持体进行电泳，由于凝若以某些凝胶为支持体进行电泳，由于凝胶的分子筛作用可影响不同胶的分子筛作用可影响不同RNARNA的泳动速度，的泳动速度，则可得到较好的分离效果。则可得到较好的分离效果。 二、二、DNADNA的提取和分离的提取和分离0. 14mol法法:三、核酸含量的测定三、核酸含量的测定1 1紫外吸收：紫外吸收：嘌呤嘌呤碱与嘧啶碱有共碱与嘧啶碱有共轭双键，使碱基轭双键，使碱基核苷、核苷酸和核苷、核苷酸和核酸在核酸在240240290290nmnm紫外波段有紫外波段有一强烈的吸收峰，一强烈的吸收峰，最大吸收值在最大吸收值在260260nmnm附近。附近。不同核苷酸有不同的吸收特性，所以可以用紫不同核苷酸有不同的吸收特性，所以可以用紫外分光光度计定量及定性测定。外分光光度计定量及定性测定。三、核酸含量的测定三、核酸含量的测定2 2对待测样品是否纯品可用对待测样品是否纯品可用260260nmnm与与280280nmnm的的ODOD值，从值，从ODOD260260/ /280280的比值即可判断。纯的的比值即可判断。纯的DNADNA的比值应为的比值应为1.81.8，纯，纯RNARNA为为2.02.0，如样品中含杂，如样品中含杂蛋白，测量比值明显下降。蛋白，测量比值明显下降。通常通常1 1ODOD值相当于值相当于5050g/mlg/ml双螺旋双螺旋DNADNA或或4040g/mlg/ml单螺旋单螺旋DNADNA（或或RNARNA）或或2020g/mlg/ml寡寡核苷酸计算。不纯的样品可用琼脂糖凝胶电核苷酸计算。不纯的样品可用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经啡啶溴红染色可粗略估泳分离出区带后，经啡啶溴红染色可粗略估计其含量。计其含量。琼脂糖凝胶电泳图琼脂糖凝胶电泳图三、核酸含量的测定三、核酸含量的测定2 2第五节第五节 核酸的变性、复性与杂交核酸的变性、复性与杂交一、变性一、变性二、复性二、复性三、杂交三、杂交四、核酸序列分析四、核酸序列分析一、变性一、变性1 1定义：定义：指核酸双螺旋区氢键断裂，变成单链，它并不涉指核酸双螺旋区氢键断裂，变成单链，它并不涉及共价键（磷酸二酯键）的断裂。及共价键（磷酸二酯键）的断裂。变性因素：变性因素：热变性、酸碱变性等。热变性、酸碱变性等。一、变性一、变性2 2一、变性一、变性3 3（TmTm值值1 1）通常把通常把DNADNA的双螺旋结构失去一半时的温度称该的双螺旋结构失去一半时的温度称该DNADNA的溶点或溶解温度，用的溶点或溶解温度，用TmTm表示，表示，DNADNA的的TmTm值一般值一般在在707085850 0C C之间。之间。变变性性的的相相对对量量温度温度0 0C C60801001.01.21.41.60TmTmTmTmTmTm100%Poly d(A-T)Poly d(G-C)DNA一、变性一、变性3 3（TmTm值值2 2）TmTm值的大小与下列因素有关：值的大小与下列因素有关： （1 1）DNADNA的均一性的均一性 （2 2）G-CG-C含量含量 （3 3）介质中的离子强度）介质中的离子强度一、变性一、变性3 3（TmTm值值3 3）影响影响TmTm值大小的因素值大小的因素1 1（1 1）DNADNA的均一性：一般均一性越高，的均一性：一般均一性越高，TmTm值的变动值的变动范围越小。范围越小。（2 2）G-CG-C含量：含量：G-CG-C含量越高，含量越高，TmTm值越大，值越大，TmTm与与G-CG-C含量成正比关系。因为含量成正比关系。因为G-CG-C比比A-TA-T更稳定（氢键）。更稳定（氢键）。TmTm与所含与所含G-CG-C的多少的关系，可用经验公式计算不的多少的关系，可用经验公式计算不同同DNADNA的的TmTm： （G GC C）(Tm(Tm69.3)2.4469.3)2.44一、变性一、变性3 3（TmTm值值4 4）TmTm与所与所含含G-CG-C的多少的多少有关有关影响影响TmTm值大小的因素值大小的因素2 2一、变性一、变性3 3（TmTm值值5 5）（3 3）介质中的离子强）介质中的离子强度：一般离子强度较低，度：一般离子强度较低，DNADNA的的TmTm值也较低，范值也较低，范围也越窄。围也越窄。温度温度0 0C C70801001.21.41.5901.11.3 A A 2602600.010.020.050.20.10.51.0影响影响TmTm值大小的因素值大小的因素3 3大肠杆菌大肠杆菌DNADNA在不同在不同KClKCl浓度下的浓度下的TmTm二、复性二、复性1 1定义：定义：变性变性DNADNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构。重新缔合成双螺旋结构。高温变性高温变性高温变性高温变性缓缓缓缓慢慢慢慢冷冷冷冷却却却却热复性热复性二、复性二、复性2 2DNADNA复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性可以得复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性可以得到部分恢复。但将热变性的到部分恢复。但将热变性的DNADNA骤然冷却，不能复性，只骤然冷却，不能复性，只有缓慢冷却时才可以复性。有缓慢冷却时才可以复性。高温变性高温变性高温变性高温变性缓缓缓缓慢慢慢慢冷冷冷冷却却却却热复性热复性急急急急速速速速冷冷冷冷却却却却复性失败复性失败二、复性二、复性3 3（影响因素）（影响因素）1 1DNADNA浓度：浓度高时，两条互补链彼此相碰的机浓度：浓度高时，两条互补链彼此相碰的机会增加，易于复性。会增加，易于复性。2 2温度：加热变性的温度：加热变性的DNADNA，当温度超过，当温度超过TmTm后，如迅后，如迅速冷却到低温时不能复性，但当溶液维持在速冷却到低温时不能复性，但当溶液维持在TmTm以下以下的较高温度时，的较高温度时， 则可复性，一般比则可复性，一般比TmTm低低25250 0C C左右左右时最佳。时最佳。3 3DNADNA片段大小的影响：大的线状单链，其扩散速片段大小的影响：大的线状单链，其扩散速度受到妨碍，减少了互补链的碰撞机会。度受到妨碍，减少了互补链的碰撞机会。三、核酸的杂交三、核酸的杂交1 1概念：两种来源概念：两种来源不同，具有互补不同，具有互补碱基序列的多核碱基序列的多核苷酸片段在溶液苷酸片段在溶液中冷却时，可以中冷却时，可以再形成双螺旋结再形成双螺旋结构，称为杂交作构，称为杂交作用。用。DNADNA和和DNADNA杂交以杂交以及及DNADNA和和RNARNA杂交杂交在核酸技术中占在核酸技术中占有十分重要的地有十分重要的地位。位。三、核酸的杂交三、核酸的杂交2 2 （一）核酸研究的主要工具酶（一）核酸研究的主要工具酶（二）核酸的杂交技术（二）核酸的杂交技术（一）核酸研究的主要工具酶（一）核酸研究的主要工具酶1 1核糖核酸酶类（核糖核酸酶类（RNARNA酶类）酶类）2 2脱氧核糖核酸酶类（脱氧核糖核酸酶类（DNADNA酶）酶）3 3非专一性核酸酶类非专一性核酸酶类1 1核糖核酸酶类（核糖核酸酶类（RNARNA酶类酶类1 1） （1 1）牛胰）牛胰RNARNA酶（酶（RNaseARNaseA或或RNaseIRNaseI） （2 2）RNARNA酶酶T T1 1（RNaseTRNaseT1 1）1 1核糖核酸酶类（核糖核酸酶类（RNARNA酶类酶类2 2） 专专一一作作用用RNARNA，而而不不作作用用于于DNA;DNA;其其分分子子量量14,00014,000，最最适适pH7.0-8.2pH7.0-8.2，十十分分耐耐热热; ;具具有有高高度度的的专专一一性性，作作用用点点为为嘧嘧啶啶核核苷苷3 3，磷磷酸酸与与其其他他核核苷苷酸酸之之间间的的连连键键，生生成成3 3，嘧嘧啶啶核核苷苷或或以以3 3，嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸结结尾尾的的寡寡核核苷苷酸酸（南南大大P152P152）。）。PPPPPP C(U) B G A(G) B C C(U) B G A(G) B C OH OHRNaseIRNaseI（1 1）牛胰）牛胰RNARNA酶（酶（RNaseARNaseA或或RNaseIRNaseI）：）：1 1核糖核酸酶类（核糖核酸酶类（RNARNA酶类酶类3 3） 比比RNaseI更更具具有有专专一一性性，其其作作用用点点为为鸟鸟嘌嘌呤呤核核苷苷3 3，- -磷磷酸酸与与其其他他核核苷苷酸酸之之间间的的连连键键，产产物物为为3 3， - -鸟鸟苷苷酸酸或或以以其其结尾的寡核苷酸。其分子量较小，耐酸耐热。结尾的寡核苷酸。其分子量较小，耐酸耐热。PPPPPP C(U) B G A(G) B C C(U) B G A(G) B C OH OHRNaseIRNaseIRNaseT1（2 2）RNARNA酶酶T T1 1（RNaseTRNaseT1 1）2 2脱氧核糖核酸酶类（脱氧核糖核酸酶类（DNADNA酶酶1 1）（1 1）牛胰脱氧核糖核酸酶（）牛胰脱氧核糖核酸酶（DnaseIDnaseI）（2 2）牛胰脱氧核糖核酸酶（）牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseIIDNaseII）（3 3）限制性内切酶）限制性内切酶( (限制酶限制酶) ) 2 2脱氧核糖核酸酶类（脱氧核糖核酸酶类（DNADNA酶酶2 2）（1 1）牛牛胰胰脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸酶酶（DnaseIDnaseI）：此此酶酶无无碱碱基基专专一一性性，它它切切断断双双链链DNADNA或或单单链链DNADNA成成为为以以5 5，磷磷酸酸为为末末端端的的寡寡核核苷苷酸酸，平平均均长长度度为为四个核苷酸，需四个核苷酸，需MgMg2+2+，最适，最适pH7-8pH7-8。（2 2）牛牛脾脾脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸酶酶（DNaseIIDNaseII）：也也无无碱碱基基专专一一性性，降降解解DNADNA成成为为以以3 3，磷磷酸酸为为末末端端的的寡寡聚聚核核苷苷酸酸，平平均均长长度度为为六六个个核核苷苷酸酸，最最适适pH4-5pH4-5，需需0.3mol/L0.3mol/L的的NaNa+ +激激活活。MgMg2+2+可可以以抑抑制制此酶的活性。此酶的活性。2 2脱氧核糖核酸酶类（脱氧核糖核酸酶类（DNADNA酶酶3-3-1 1）是是19791979年年，ArberArber、SmithSmith和和NathamsNathams等等人人在在细细菌菌体体内内发发现现的的一一类类对对DNADNA具具有有极极高高碱碱基基专专一一性性的的内内切切酶。酶。是是DNADNA顺顺序序测测定定，基基因因分分离离和和基基因因体体外外重重组组等等研研究中十分重要的工具酶。究中十分重要的工具酶。这这类类酶酶主主要要降降解解外外源源的的未未经经特特殊殊修修饰饰的的DNADNA，但但不降解自身细胞的不降解自身细胞的DNADNA。一般识别顺序包含一般识别顺序包含4-64-6个碱基对。个碱基对。（3 3）限制性内切酶）限制性内切酶( (限制酶限制酶) )2 2脱氧核糖核酸酶类（脱氧核糖核酸酶类（DNADNA酶酶3-3-2 2） 大大多多数数限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别顺顺序序具具有有回回文文结结构构（反向重复序列）。（反向重复序列）。（3 3）限制性内切酶）限制性内切酶( (限制酶限制酶)2)2T T A G C A C G T G C T A AT T A G C A C G T G C T A AA A T C G T G C A C G A T TA A T C G T G C A C G A T T反向重复反向重复3，5，3，5，2 2脱氧核糖核酸酶类（脱氧核糖核酸酶类（DNADNA酶酶3-3-3 3）大多数酶切割后形成粘末端大多数酶切割后形成粘末端（3 3）限制性内切酶）限制性内切酶( (限制酶限制酶)3)3G A A T T CG A A T T CC T T A A GC T T A A G3，5，3，5，EcoRIG A A T T CG A A T T CC T T A A GC T T A A G3，5，3，5，+粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端2 2脱氧核糖核酸酶类（脱氧核糖核酸酶类（DNADNA酶酶3-3-4 4）少数酶切割后形成平整末端少数酶切割后形成平整末端（3 3）限制性内切酶）限制性内切酶( (限制酶限制酶)3)3G T Py Pu A CG T Py Pu A CC A Pu Py T GC A Pu Py T G3，5，3，5，HindII平整末端平整末端G T Py Pu A CG T Py Pu A CC A Pu Py T GC A Pu Py T G3，5，3，5，+3 3非专一性核酸酶类非专一性核酸酶类1 1（1 1）蛇毒磷酸二酯酶）蛇毒磷酸二酯酶（2 2）牛脾磷酸二酯酶）牛脾磷酸二酯酶3 3非专一性核酸酶类非专一性核酸酶类2 2（1 1） 对对RNARNA、DNADNA都都有有作作用用，是是从从核核苷苷酸酸链链的的3 3，羟羟基基端端开开始始，逐逐个个切切开开5 5， 核核苷苷酸酸与与相相邻邻核核苷苷酸酸之间的酯键，得到之间的酯键，得到5 5，核苷酸。核苷酸。（1 1）蛇毒磷酸二酯酶）蛇毒磷酸二酯酶PPPH2O OH OHPPP OH OH OH OH+3 3非专一性核酸酶类非专一性核酸酶类2 2（2 2） 可可作作用用RNARNA和和DNADNA，是是从从5 5，- -羟羟基基端端开开始始，逐逐个个切切开开3 3，- -核核苷苷酸酸与与相相邻邻核核苷苷酸酸之之间的酯键，得间的酯键，得3 3，核苷酸。核苷酸。PPPH2O OH OH+（2 2）牛脾磷酸二酯酶）牛脾磷酸二酯酶PP OH OHPPP OH OH（二）核酸的杂交技术（二）核酸的杂交技术1 1意意义义：核核酸酸杂杂交交可可以以在在液液相相或或固固相相上上进进行行，是是基基因因工工程程和和分分子子生生物物学学的的重重要要技技术术之之一一。是是鉴鉴定定阳阳性性重重组组体体、筛筛选选基基因因、确确定定DNADNA的的同同源源性性、研研究究基基因因定定位位、组组建建DNADNA的的物物理图谱、研究理图谱、研究DNADNA的间隔顺序等的有效手段。的间隔顺序等的有效手段。原原理理: :核核酸酸（DNADNA）的的变变性性和和复复性性的的性性质质，也也就就是是在在带带有有互互补补顺顺序序的的同同源源单单链链间间的的配配对对过过程程中中，DNADNA单单链链可可重重新新形形成成双双链链，DNADNA单单链链也也可可与与RNARNA互互补补成成为为杂杂交交分分子子。因因此此有有DNADNA类类、DNA-RNADNA-RNA类类两两种种杂杂交交。如如把把已已知知序序列列的的分分子子预预先先用用放放射射性性同同位位素素（3232P P）标标记记（称称为为探探针针，ProbeProbe），即即可可用用其识别或其识别或“钓出钓出”另一分子中的同源部分。另一分子中的同源部分。（二）核酸的杂交技术（二）核酸的杂交技术2 2Southern Southern 印印迹迹法法: :利利用用上上述述原原理理，19751975年年英英国国分分子子生生物物学学家家E.M.SouthernE.M.Southern首首先先发发明明的的一一种种杂杂交交 “印迹法印迹法”。此此法法是是将将凝凝胶胶上上的的DNADNA片片段段转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上后，再进行杂交上后，再进行杂交具体方法参见北大具体方法参见北大P352,353P352,353。（二）核酸的杂交技术（二）核酸的杂交技术3 3（1 1）1 1将将DNADNA样样品品经经限限制制性性内内切切酶酶降降解解后后，用用琼琼酯酯糖糖凝胶电泳进行分离凝胶电泳进行分离2 2将胶浸泡在碱（将胶浸泡在碱（NaOHNaOH）中使中使DNADNA变性变性3 3将将变变性性DNADNA转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维膜膜上上（膜膜只只吸吸附附变变性的性的DNADNA）4 480800 0C C烤烤4-64-6h h，使使DNADNA牢固地吸附在膜上牢固地吸附在膜上DNADNA DNA DNA杂交实验法杂交实验法1 1（二）核酸的杂交技术（二）核酸的杂交技术3 3（2 2）5 5与与放放射射性性同同位位素素标标记记的的、变变性性后后的的DNADNA探探针针进进行行杂杂交交，此此过过程程需需要要在在较较高高的的盐盐浓浓度度及及适适当当的的温温度度（一般（一般68680 0C C）下进行了几十几个小时下进行了几十几个小时6 6洗涤除去杂交标记物洗涤除去杂交标记物7 7将膜烘干后进行放射自显影将膜烘干后进行放射自显影DNADNA DNA DNA杂交实验法杂交实验法2 2（二）核酸的杂交技术（二）核酸的杂交技术3 3（3 3）NorthernNorthern印印迹迹法法: :根根据据此此原原理理，19771977年年G.R G.R StarkStark建立了测定建立了测定RNARNA的分子杂交技术。的分子杂交技术。Western Western blotingbloting: :用用类类似似的的方方法法，根根据据抗抗体体与与抗原可以结合的原理，开发了分析蛋白质的方法。抗原可以结合的原理，开发了分析蛋白质的方法。DNADNA DNA DNA杂交实验法杂交实验法3 3四、核酸序列分析四、核酸序列分析1 119651965年年Robert Robert HolleyHolley首首先先用用测测蛋蛋白白质质氨氨基基酸酸的的序列方法（重叠法）测定了酵母丙氨酸序列方法（重叠法）测定了酵母丙氨酸tRNAtRNA的序列。的序列。19771977年年两两位位学学者者提提出出了了化化学学裂裂解解法法和和双双脱脱氧氧酶酶法法。这这两两种种方方法法的的基基本本原原理理相相同同，都都是是用用不不同同的的专专一一性性手手段段使使被被分分析析的的DNADNA分分子子断断裂裂成成若若干干带带放放射射性性标标记记的的、长长短短不不一一的的片片段段，然然后后用用测测DNADNA片片段段的的相相对对长长度度来来测测核核苷苷酸酸的的顺顺序序。即即利利用用凝凝胶胶电电泳泳使使各各种种片片段段分分离离，再再用用放放射射自自显显影影法法显显影影。从从放放射射自自显显影影（分分子子生生物物学学中中讲讲）图图谱谱读读出出被被测测核核苷苷酸酸的的序序列列。（具具体参见北大体参见北大P487P487489489）四、核酸序列分析四、核酸序列分析2 2(1)(1)待测序列待测序列A T T A G A C G T C C G T G C A A T G CA T T A G A C G T C C G T G C A A T G C3，5，双脱氧酶法测定双脱氧酶法测定DNADNA顺序顺序1 1引物及固定端引物及固定端加引物加引物A C G T T A C GA C G T T A C G3，5，A T T A G A C G T C C G T G C A A T G CA T T A G A C G T C C G T G C A A T G CA C G T T A C GA C G T T A C G3，5，3，5，以以2，、，、3，双脱氧三磷，双脱氧三磷酸（酸（ 2，、，、3，d dNTP)来来中止中止DNA的复制反应的复制反应加加32PdATP， dTTP， dGTP ，dCTP分成四份进行反应分成四份进行反应四、核酸序列分析四、核酸序列分析2 2(2)(2)双脱氧酶法测定双脱氧酶法测定DNADNA顺序顺序2 2加加ddATP/klenow片断片断加加ddTTP /klenow片断片断加加ddGTP /klenow片断片断加加ddCTP /klenow片断片断ACGTTACGACGTTACG3，ddAGGCddAGGCddATCTGCAGGCddATCTGCAGGCddAATCTGCAGGCddAATCTGCAGGC5，5，5，3，3，3，ddTGCAGGCddTGCAGGCddTCTGCAGGCddTCTGCAGGCddTAATCTGCAGGCddTAATCTGCAGGC5，5，5，3，3，3，ddGCddGCddGGCddGGCddGCAGGCddGCAGGC5，5，5，3，3，3，ddCddCddCAGGCddCAGGCddCTGCAGGCddCTGCAGGC5，5，5，3，3，加在序列加在序列胶之胶之A行行加在序列加在序列胶之胶之T行行加在序列加在序列胶之胶之G行行加在序列加在序列胶之胶之C行行