第二章第二章第二章第二章 基因工程的基本条件基因工程的基本条件基因工程的基本条件基因工程的基本条件一、用于核酸操作的工具酶一、用于核酸操作的工具酶一、用于核酸操作的工具酶一、用于核酸操作的工具酶二、二、二、二、基因克隆载体基因克隆载体基因克隆载体基因克隆载体三、目的基因的制备三、目的基因的制备三、目的基因的制备三、目的基因的制备四、基因工程受体菌或细胞四、基因工程受体菌或细胞四、基因工程受体菌或细胞四、基因工程受体菌或细胞二、基因克隆载体二、基因克隆载体二、基因克隆载体二、基因克隆载体（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征（二）质粒（二）质粒（二）质粒（二）质粒（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒DNADNA（四）（四）（四）（四）CosCos质粒与噬菌粒质粒与噬菌粒质粒与噬菌粒质粒与噬菌粒（五）人工染色体载体（五）人工染色体载体（五）人工染色体载体（五）人工染色体载体（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征 在基因工程操作中，能携带外源在基因工程操作中，能携带外源DNA进入受体细胞的进入受体细胞的DNA分子。分子。载体载体(vector)： 载体的功能：载体的功能：载体的功能：载体的功能：为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。运送外源基因高效转入受体细胞；运送外源基因高效转入受体细胞；运送外源基因高效转入受体细胞；运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因提供复制能力或整合能力；载体应具备的条件：载体应具备的条件：载体应具备的条件：载体应具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性( (可转移性可转移性可转移性可转移性) )； 具有合适的筛选标记。具有合适的筛选标记。具有合适的筛选标记。具有合适的筛选标记。 具有较高的外源具有较高的外源具有较高的外源具有较高的外源DNADNA载装能力；载装能力；载装能力；载装能力； 具有多种单一的限制酶酶切位点；具有多种单一的限制酶酶切位点；具有多种单一的限制酶酶切位点；具有多种单一的限制酶酶切位点； 具有与受体细胞相适应的复制位点或整合位点；具有与受体细胞相适应的复制位点或整合位点；具有与受体细胞相适应的复制位点或整合位点；具有与受体细胞相适应的复制位点或整合位点； 基本概念：基本概念：基本概念：基本概念：2 2）存存存存在在在在于于于于细细细细菌菌菌菌、真真真真菌菌菌菌、蓝蓝蓝蓝藻、酵母等细胞中藻、酵母等细胞中藻、酵母等细胞中藻、酵母等细胞中。（二）质粒（二）质粒（二）质粒（二）质粒(plasmid)(plasmid)1 1）是是是是生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞内内内内固固固固有有有有的的的的、能能能能独独独独立立立立于于于于染染染染色色色色体体体体而而而而自自自自主主主主复复复复制制制制、并并并并被被被被稳稳稳稳定定定定遗遗遗遗传传传传的的的的核核核核酸酸酸酸分子。分子。分子。分子。The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cellplasmid DNAGenomic DNA4 4）绝绝绝绝大大大大多多多多数数数数的的的的天天天天然然然然DNADNA质质质质粒粒粒粒具具具具有有有有共共共共价价价价、闭闭闭闭合合合合、环环环环状状状状的的的的双双双双链链链链结结结结构构构构( (c covalently ovalently c closed losed c circular ircular DNA, DNA, cccDNAcccDNA) )，以超螺旋形式存在。，以超螺旋形式存在。，以超螺旋形式存在。，以超螺旋形式存在。3 3）绝大多数质粒是）绝大多数质粒是）绝大多数质粒是）绝大多数质粒是DNADNA型的；型的；型的；型的；酵母的杀伤质粒酵母的杀伤质粒(killer plasmid)是是RNA。7 7）最大装载量：）最大装载量：）最大装载量：）最大装载量：15 15 kbkb（5%5%）。5 5）分子大小：）分子大小：）分子大小：）分子大小：1-300 1-300 kbkb； 编编码码2-3个个中中等等大大小小的的蛋蛋白白质质，如如抗抗生生素素抗抗性性、代代谢谢特特征征等等，赋赋予予细细菌菌一一些些额额外外的的特特性（非必须）。性（非必须）。6）编码基因：编码基因：质质粒粒不不是是单单纯纯的的寄寄生生，携携带带的的遗遗传传信信息息赋赋予予细细菌菌特定的遗传性状，如抗生素抗性基因特定的遗传性状，如抗生素抗性基因Ampr。质粒与宿主细胞的关系：质粒与宿主细胞的关系：质质粒粒对对宿宿主主的的生生存存不不是是必必需需的的，只只是是“友友好好”的的“借居借居”宿主细胞中。宿主细胞中。质质粒粒离离开开宿宿主主就就无无法法生生存存，只只有有依依赖赖宿宿主主细细胞胞的帮助，才能完成自身的复制、转录。的帮助，才能完成自身的复制、转录。质粒的基本特征：质粒的基本特征：质粒的基本特征：质粒的基本特征：自主复制性自主复制性自主复制性自主复制性不相容性不相容性不相容性不相容性可转移性可转移性可转移性可转移性 携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记1 1、自主复制性、自主复制性、自主复制性、自主复制性 质质质质粒粒粒粒DNADNA上上上上的的的的复复复复制制制制子子子子结结结结构构构构决决决决定定定定了了了了质质质质粒粒粒粒与与与与寄主的对应关系。寄主的对应关系。寄主的对应关系。寄主的对应关系。 质质质质粒粒粒粒能能能能利利利利用用用用寄寄寄寄主主主主细细细细胞胞胞胞的的的的DNADNA复复复复制制制制系系系系统统统统，进行自主复制。进行自主复制。进行自主复制。进行自主复制。 严紧型质粒严紧型质粒严紧型质粒严紧型质粒 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为：多寡，质粒可分为：松弛型质粒松弛型质粒松弛型质粒松弛型质粒 1-31-3拷贝拷贝拷贝拷贝/cell/cell，复制受细胞核控制，复制受细胞核控制，复制受细胞核控制，复制受细胞核控制，伴随染色体伴随染色体伴随染色体伴随染色体DNADNA复制而复制。复制而复制。复制而复制。复制而复制。如：如：pSC101、p15A。1 1）严紧型质粒）严紧型质粒）严紧型质粒）严紧型质粒(stringent plasmid)(stringent plasmid)： 加加加加入入入入氯氯氯氯霉霉霉霉素素素素（终终终终浓浓浓浓度度度度10-17010-170 g/mlg/ml）抑抑抑抑制细菌蛋白质合成后，可达制细菌蛋白质合成后，可达制细菌蛋白质合成后，可达制细菌蛋白质合成后，可达30003000拷贝拷贝拷贝拷贝/cell /cell 。2 2）松弛型质粒）松弛型质粒）松弛型质粒）松弛型质粒(relaxed plasmid)(relaxed plasmid)： 如：如：pMB1、ColE1。 10-20010-200拷拷拷拷贝贝贝贝/cell/cell，复复复复制制制制不不不不受受受受细细细细胞胞胞胞核核核核控控控控制制制制，染色体染色体染色体染色体DNADNA复制停止时，仍可进行复制。复制停止时，仍可进行复制。复制停止时，仍可进行复制。复制停止时，仍可进行复制。 2 2、不相容性、不相容性、不相容性、不相容性(incompatibility)(incompatibility) 指指指指任任任任何何何何两两两两种种种种含含含含相相相相似似似似复复复复制制制制子子子子结结结结构构构构的的的的不不不不同同同同质粒，不能同时存在于一个细胞中。质粒，不能同时存在于一个细胞中。质粒，不能同时存在于一个细胞中。质粒，不能同时存在于一个细胞中。分子机制：分子机制：分子机制：分子机制： 两两两两种种种种含含含含不不不不同同同同复复复复制制制制子子子子结结结结构构构构的的的的不不不不同同同同质质质质粒粒粒粒，在在在在复复复复制制制制时时时时受受受受各各各各自自自自的的的的拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数控控控控制制制制系系系系统统统统调调调调节节节节，致致致致使使使使两两两两种种种种质质质质粒粒粒粒的的的的最最最最终终终终拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数恒恒恒恒定定定定，经经经经若若若若干干干干复复复复制制制制周周周周期期期期和和和和细细细细胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞内。胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞内。胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞内。胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞内。 两两两两种种种种含含含含相相相相似似似似复复复复制制制制子子子子结结结结构构构构的的的的不不不不同同同同质质质质粒粒粒粒，在在在在复复复复制制制制时时时时受受受受同同同同一一一一拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数控控控控制制制制系系系系统统统统的的的的干干干干扰扰扰扰，致致致致使使使使两两两两种种种种质质质质粒粒粒粒的的的的最最最最终终终终拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数不不不不同同同同，其其其其中中中中拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数多多多多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 不相容性的质粒组成不相容性的质粒组成不相容性的质粒组成不相容性的质粒组成不相容性群不相容性群不相容性群不相容性群，如：，如：，如：，如：ColE1ColE1、pMB1pMB1有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；pSC101pSC101、F F、RP4RP4有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；p15Ap15A及其衍生质粒有相似复制子结构，彼此不相容。及其衍生质粒有相似复制子结构，彼此不相容。及其衍生质粒有相似复制子结构，彼此不相容。及其衍生质粒有相似复制子结构，彼此不相容。3 3、可转移性、可转移性、可转移性、可转移性接合型质粒接合型质粒接合型质粒接合型质粒(conjunctive plasmid)(conjunctive plasmid)革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒( (nonconjunctivenonconjunctive plasmid) plasmid) 除除除除带带带带有有有有自自自自我我我我复复复复制制制制所所所所必必必必需需需需的的的的遗遗遗遗传传传传信信信信息息息息外外外外，还还还还带带带带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。1 1）接合型质粒：）接合型质粒：）接合型质粒：）接合型质粒： 能能能能在在在在天天天天然然然然条条条条件件件件下下下下自自自自发发发发地地地地从从从从一一一一个个个个细细细细胞胞胞胞转转转转移移移移到到到到另另另另一个细胞，如一个细胞，如一个细胞，如一个细胞，如F F质粒质粒质粒质粒。 符合基因工程的符合基因工程的符合基因工程的符合基因工程的安全安全安全安全要求。要求。要求。要求。2 2）非接合型质粒：）非接合型质粒：）非接合型质粒：）非接合型质粒： 不不不不能能能能在在在在天天天天然然然然条条条条件件件件下下下下独独独独立立立立地地地地发发发发生生生生接接接接合合合合作作作作用用用用，如如如如ColE1ColE1质粒质粒质粒质粒。 虽虽虽虽带带带带有有有有自自自自我我我我复复复复制制制制所所所所必必必必需需需需的的的的遗遗遗遗传传传传信信信信息息息息，但但但但失失失失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 值值得得注注意意的的是是，某某些些非非接接合合型型质质粒粒（如如ColE1）在在接接合合型型质质粒粒的的存存在在和和协协助助下下，也也能能发发生生DNA转转移移，这这个个过过程程由由 bom和和mob基因决定。基因决定。 4 4、携带特殊的遗传标记、携带特殊的遗传标记、携带特殊的遗传标记、携带特殊的遗传标记 这些标记基因对重组这些标记基因对重组这些标记基因对重组这些标记基因对重组DNADNA筛选筛选筛选筛选有重要意义。有重要意义。有重要意义。有重要意义。 野野野野生生生生型型型型质质质质粒粒粒粒DNADNA上上上上往往往往往往往往携携携携带带带带一一一一个个个个或或或或多多多多个个个个遗遗遗遗传传传传标标标标记基因，使寄主产生正常生长非必需的附加性状。记基因，使寄主产生正常生长非必需的附加性状。记基因，使寄主产生正常生长非必需的附加性状。记基因，使寄主产生正常生长非必需的附加性状。物质抗性：物质抗性：物质抗性：物质抗性：物质合成：物质合成：物质合成：物质合成：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱质粒的空间构型：质粒的空间构型：共价、闭合、环状共价、闭合、环状DNA(cccDNA)超螺旋超螺旋(super coil DNA, scDNA)开环开环DNA(open circular DNA, ocDNA)一条链上有一至数个缺口一条链上有一至数个缺口线形线形DNA(linear DNA, L-DNA)质粒空间构型与电泳速率：质粒空间构型与电泳速率：质粒空间构型与电泳速率：质粒空间构型与电泳速率： 同同一一质质粒粒尽尽管管分分子子量量相相同同，不不同同的的构构型型电电泳泳迁迁移移率率不不同同：cccDNA最最快快、L-DNA次次之之、ocDNA最慢。最慢。cccDNAcccDNAL-DNAL-DNA ocDNAocDNA质粒的分类质粒的分类质粒的分类质粒的分类 1 1、按功能：、按功能：、按功能：、按功能： F F质粒质粒质粒质粒(fertility factor)(fertility factor)R R质粒质粒质粒质粒(resistance factor)(resistance factor)Col质粒质粒(coliconogenic factor)1 1）F F质粒：质粒：质粒：质粒： 性质粒，决定细菌性别，能在天然条件下性质粒，决定细菌性别，能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞。自发地从一个细胞转移到另一个细胞。 R R质粒：质粒：质粒：质粒： 抗药性质粒，抗药性质粒，带有一种或多种抗生素抗性带有一种或多种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状。基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状。RTF: resistance trarnsfer factor Col质粒：质粒： 大大肠肠杆杆菌菌素素质质粒粒，带带有有控控制制大大肠肠杆杆菌菌素素合合成成的的基基因因，合合成成大大肠肠杆杆菌菌素素，杀杀死死不不含含Col质粒的亲缘细菌。质粒的亲缘细菌。接合型质粒接合型质粒接合型质粒接合型质粒2 2、按转移方式：、按转移方式：、按转移方式：、按转移方式：非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒3 3、按复制机理：按复制机理：按复制机理：按复制机理： 接合型质粒分子量大，一般属严紧型。接合型质粒分子量大，一般属严紧型。接合型质粒分子量大，一般属严紧型。接合型质粒分子量大，一般属严紧型。严紧型质粒：严紧型质粒：严紧型质粒：严紧型质粒：松弛型质粒：松弛型质粒：松弛型质粒：松弛型质粒：非非非非接合型质粒分子量小，一般属接合型质粒分子量小，一般属接合型质粒分子量小，一般属接合型质粒分子量小，一般属松弛型。松弛型。松弛型。松弛型。4、按分子量大小：按分子量大小： 15kb，多为接合型质粒；，多为接合型质粒； 15kb，多为非接合型质粒。，多为非接合型质粒。 大型质粒大型质粒:小型质粒小型质粒:质粒的构建质粒的构建质粒的构建质粒的构建分子量大；分子量大；分子量大；分子量大； 野生型质粒的特性提供了以其为基础、野生型质粒的特性提供了以其为基础、人工构建载体分子的可能。人工构建载体分子的可能。野生型野生型野生型野生型质粒的缺陷：质粒的缺陷：质粒的缺陷：质粒的缺陷：拷贝数低；拷贝数低；拷贝数低；拷贝数低；单一酶切位点少；单一酶切位点少；单一酶切位点少；单一酶切位点少；遗传标记不理想。遗传标记不理想。遗传标记不理想。遗传标记不理想。如如：天天然然质质粒粒pSC101分分子子量量9.09kb，只只有有1个个EcoR I切点充当克隆位点，筛选标志只有切点充当克隆位点，筛选标志只有Tetr。 可可通通过过插插入入失失活活筛筛选选，但但免免疫疫筛筛选选E1的的操作非常麻烦。操作非常麻烦。 ColE1的的筛筛选选标标志志是是大大肠肠杆杆菌菌素素E1，唯唯一一的克隆位点的克隆位点EcoR I正好位于这个基因内部。正好位于这个基因内部。 大大于于20kb的的质质粒粒很很难难导导入入受受体体细细胞胞，且且极不稳定。极不稳定。质粒的改造与构建：质粒的改造与构建： 尽尽量量缩缩小小质质粒粒的相对分子量，提高外源的相对分子量，提高外源DNA的装载量。的装载量。1）删除不必要的）删除不必要的DNA区域区域， 灭灭活活对对质质粒粒复复制制产产生生负负调调控控效效应应的的基基因因，提高质粒的提高质粒的拷贝数拷贝数。2）灭活某些编码基因）灭活某些编码基因 灭灭活活促促进进质质粒粒在在细细菌菌种种间间转转移移的的mob基基因因，杜杜绝绝重重组组质质粒粒扩扩散散污污染染环环境境，保保证证DNA重重组组实验的实验的安全性安全性。 最最好好有有两两种种选选择择标标记记基基因因，并并且且在在选选择标记基因区内有合适的克隆位点。择标记基因区内有合适的克隆位点。3）加入选择标记基因：）加入选择标记基因： 当当外外源源DNA片片段段插插入入克克隆隆位位点点后后，标标记基因失活，成为选择克隆子的依据。记基因失活，成为选择克隆子的依据。氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（ampicillin, Ampr）卡那霉素抗性（卡那霉素抗性（kanamycin, Kanr）四环素抗性（四环素抗性（tetracycline, Tetr）链霉素抗性（链霉素抗性（streptomycin, Strr）氯霉素抗性（氯霉素抗性（chloromycetin, Chlr）常用的选择标记：常用的选择标记：2）根据克隆子蓝白颜色进行筛选的）根据克隆子蓝白颜色进行筛选的lacZ基因。基因。1）抗生素抗性抗生素抗性基因：基因：3）在在选选择择标标记记基基因因内内，引引入入人人工工合合成成的的多多种种限限制制酶酶连连续续酶酶切切位位点点的的DNA短短序序列列，即即多多克克隆隆位位点点(multiple cloning sites, MCS)，也也称称多多酶酶接接头头(polylinker)。 同时同时删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点，使其单一化。，使其单一化。4）根根据据外外源源基基因因克克隆隆的的不不同同要要求求，分分别别加装特殊的基因加装特殊的基因表达调控元件表达调控元件。实验室用质粒多以少数几个野生型质粒为基础构建：实验室用质粒多以少数几个野生型质粒为基础构建：实验室用质粒多以少数几个野生型质粒为基础构建：实验室用质粒多以少数几个野生型质粒为基础构建：pSC101pSC101：8.8kb8.8kb，拷贝数，拷贝数，拷贝数，拷贝数5 5，四环素抗性基因，四环素抗性基因，四环素抗性基因，四环素抗性基因TetTetrr。ColE1ColE1：6.56.5kbkb，拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数20-3020-30（氯氯氯氯霉霉霉霉素素素素诱诱诱诱导导导导可可可可达达达达1000-30001000-3000），大肠杆菌素基因），大肠杆菌素基因），大肠杆菌素基因），大肠杆菌素基因E1E1。RSF2124RSF2124：ColE1ColE1衍衍衍衍生生生生质质质质粒粒粒粒，氨氨氨氨苄苄苄苄青青青青霉霉霉霉素素素素抗抗抗抗性性性性基基基基因因因因AmpAmprr。人工构建的质粒根据其功能和用途，分为：人工构建的质粒根据其功能和用途，分为：人工构建的质粒根据其功能和用途，分为：人工构建的质粒根据其功能和用途，分为： 整合质粒整合质粒整合质粒整合质粒测序质粒测序质粒测序质粒测序质粒高拷贝质粒高拷贝质粒高拷贝质粒高拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒温敏质粒温敏质粒温敏质粒温敏质粒探针质粒探针质粒探针质粒探针质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒表达质粒表达质粒表达质粒表达质粒1 1、高拷贝质粒：、高拷贝质粒：、高拷贝质粒：、高拷贝质粒：1）含含有有氯氯霉霉素素可可扩扩增增的的松松弛弛型型复复制制子子结结构构，如如ColE1、pMB1派生质粒、派生质粒、pBR系列；系列；用于用于克隆克隆和和扩增扩增外源基因。外源基因。2）复复制制子子经经人人工工诱诱变变，解解除除对对质质粒粒拷拷贝贝数数的的负负控控制制作作用用，使使质质粒粒在在每每个个细细胞胞中中达达数数千千拷贝。拷贝。如：如：如：如：pBR322pBR322： pBR3224,363 bporiROPROISal IBamH ITetrPvu IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAmprPst I松弛复制型松弛复制型松弛复制型松弛复制型拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 50-100/ 50-100/cellcell含含Ampr、Tetrp: plasmid；BR: 取取自自构构建建者者F.Bo1ivar和和R.L.Rodriguez姓的首字母；姓的首字母；322: 实验室编号。实验室编号。用于基因克隆和扩增用于基因克隆和扩增ori-ColE1Tetr-pSC101Ampr-pSP21242 2、低拷贝质粒：、低拷贝质粒：、低拷贝质粒：、低拷贝质粒： 某某某某些些些些毒毒毒毒性性性性基基基基因因因因的的的的表表表表达达达达产产产产物物物物过过过过多多多多时时时时，会会会会严严严严重重重重影影影影响响响响宿宿宿宿主主主主菌菌菌菌的的的的正正正正常常常常代代代代谢谢谢谢活活活活动动动动、导导导导致致致致宿宿宿宿主主主主菌菌菌菌死亡，就需要低拷贝载体。死亡，就需要低拷贝载体。死亡，就需要低拷贝载体。死亡，就需要低拷贝载体。 如如如如pLG338/339pLG338/339、pHSG415pHSG415等等等等pSC101pSC101派派派派生生生生质粒质粒质粒质粒，拷贝数，拷贝数，拷贝数，拷贝数1010，用于用于用于用于表达表达表达表达某些某些某些某些毒性基因毒性基因毒性基因毒性基因。3 3、温敏质粒：、温敏质粒：、温敏质粒：、温敏质粒： 即温度敏感型复制控制质粒，在不同温度即温度敏感型复制控制质粒，在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质。下表现出拷贝数、整合等不同性质。温度温度 40时，拷贝数很快增至时，拷贝数很快增至1000个以上。个以上。如如：1979年年B.E.Uhlin构建的构建的pBEU1、pBEU2：4 4、测序质粒：、测序质粒：、测序质粒：、测序质粒： 高高高高拷拷拷拷贝贝贝贝复复复复制制制制，含含含含有有有有多多多多克克克克隆隆隆隆位位位位点点点点( (MCSMCS) )，便便便便于于于于外外外外源源源源DNADNA的的的的克克克克隆隆隆隆与与与与扩扩扩扩增增增增，在在在在MCSMCS两两两两端端端端邻邻邻邻近近近近区域，有区域，有区域，有区域，有通用引物通用引物通用引物通用引物互补序列，便于互补序列，便于互补序列，便于互补序列，便于测序测序测序测序。如：如：pUC18/19、M13 mp系列、系列、pGEM-T。如：如：如：如：pUC18pUC18/19/19：rBamH IpUC182,686 bpAmplacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTEcoR I Sst IKpn I Sma IXba ISal IPst I Sph I Hind III拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 2000-3000/ 2000-3000/cellcell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点MCSMCS正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ University of California的的J.Messing和和J.Vieria构建构建ori-PBR322、Ampr-PBR322pUC18/pUC18/1919正选择标记正选择标记正选择标记正选择标记lacZlacZ 的显色原理的显色原理的显色原理的显色原理: :pUC18pUC18/19/19PlacPlaclacZlacZMCSMCS 底物：底物：底物：底物：5-5-溴溴溴溴-4-4-氯氯氯氯-3-3-吲哚吲哚吲哚吲哚基基基基- - -D-D-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷（X-galX-gal） - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶 - -亚基亚基亚基亚基 诱导物：异丙基硫代半乳糖苷诱导物：异丙基硫代半乳糖苷诱导物：异丙基硫代半乳糖苷诱导物：异丙基硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝（ - -互补）互补）互补）互补）5 5、整合质粒：、整合质粒：、整合质粒：、整合质粒： 含含含含整整整整合合合合酶酶酶酶编编编编码码码码基基基基因因因因和和和和整整整整合合合合特特特特异异异异性性性性位位位位点点点点序序序序列列列列，克克克克隆隆隆隆在在在在这这这这种种种种质质质质粒粒粒粒上上上上的的的的外外外外源源源源基基基基因因因因进进进进入入入入受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞后后后后，能能能能准准准准确确确确整整整整合合合合在在在在受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞染染染染色色色色体体体体DNADNA的特定位点。的特定位点。的特定位点。的特定位点。 便于便于便于便于外源基因的外源基因的外源基因的外源基因的整合整合整合整合。6 6、穿梭质粒、穿梭质粒、穿梭质粒、穿梭质粒(shuttle plasmid)(shuttle plasmid)：如：如：如：如：E.coliE.coli- -酵母菌、酵母菌、酵母菌、酵母菌、E.coliE.coli- -哺乳动物细胞穿梭质粒。哺乳动物细胞穿梭质粒。哺乳动物细胞穿梭质粒。哺乳动物细胞穿梭质粒。 克隆的外源基因可不用更换载体、直接从一克隆的外源基因可不用更换载体、直接从一克隆的外源基因可不用更换载体、直接从一克隆的外源基因可不用更换载体、直接从一种受体菌转入另一种受体菌中复制并遗传。种受体菌转入另一种受体菌中复制并遗传。种受体菌转入另一种受体菌中复制并遗传。种受体菌转入另一种受体菌中复制并遗传。 含含含含有有有有两两两两个个个个亲亲亲亲缘缘缘缘关关关关系系系系不不不不同同同同的的的的复复复复制制制制子子子子结结结结构构构构、相相相相应应应应的的的的选选选选择择择择标标标标记记记记基基基基因因因因，能能能能在在在在两两两两种种种种不不不不同同同同种种种种属属属属的的的的受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞中复制并被检测。中复制并被检测。中复制并被检测。中复制并被检测。 E.coliE.coli- -Pichia.pastorisPichia.pastoris穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒E.coliE.coli-HEK293-HEK293穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒7 7、表达质粒：、表达质粒：、表达质粒：、表达质粒： 在多克隆位点的上、下游，分别装有强在多克隆位点的上、下游，分别装有强在多克隆位点的上、下游，分别装有强在多克隆位点的上、下游，分别装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化元件，化外源基因表达的转录、翻译、纯化元件，化外源基因表达的转录、翻译、纯化元件，化外源基因表达的转录、翻译、纯化元件，使外源基因能在受体细胞中使外源基因能在受体细胞中使外源基因能在受体细胞中使外源基因能在受体细胞中高效表达高效表达高效表达高效表达、便于、便于、便于、便于下游下游下游下游纯化纯化纯化纯化。pGEM-3ZpGEM-3Z：装有装有装有装有2 2个噬菌体的强启动子个噬菌体的强启动子个噬菌体的强启动子个噬菌体的强启动子装有多克隆位点装有多克隆位点装有多克隆位点装有多克隆位点(MCS)(MCS)正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ 用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 注注注注意意意意：T7T7和和和和SP6SP6启启启启动动动动子子子子特特特特异异异异性性性性地地地地由由由由噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体RNARNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶识识识识别别别别，相相相相应应应应的的的的受受受受体体体体菌菌菌菌需需需需表表表表达达达达噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体RNARNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶，如如如如BL21(BL21(表达表达表达表达T7 RNAT7 RNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶) )。MCSMCSlacZlacZPPT7T7orioriAmpAmprr2,743 2,743 bpbppGEM-3ZpGEM-3ZPPSP6SP6 pET-3a pET-3a： pET-28a pET-28a： 只只只只有有有有含含含含启启启启动动动动子子子子或或或或终终终终止止止止子子子子的的的的外外外外源源源源DNADNA插插插插入入入入载载载载体体体体的的的的合合合合适适适适位位位位点点点点，报报报报告告告告基基基基因因因因才才才才能能能能表表表表达达达达，表表表表达达达达量量量量的的的的高高高高低低低低直接反映表达调控元件的强弱。直接反映表达调控元件的强弱。直接反映表达调控元件的强弱。直接反映表达调控元件的强弱。8、探针质粒：、探针质粒： 用于用于用于用于筛选表达调控元件筛选表达调控元件筛选表达调控元件筛选表达调控元件，如启动子、终止子。，如启动子、终止子。，如启动子、终止子。，如启动子、终止子。 通通通通常常常常装装装装有有有有一一一一个个个个可可可可定定定定量量量量检检检检测测测测表表表表达达达达程程程程度度度度的的的的报报报报告告告告基基基基因因因因（如如如如抗抗抗抗生生生生素素素素抗抗抗抗性性性性基基基基因因因因），但但但但缺缺缺缺少少少少相相相相应应应应的的的的启启启启动动动动子子子子或终止子，因此本身不能表达报告基因。或终止子，因此本身不能表达报告基因。或终止子，因此本身不能表达报告基因。或终止子，因此本身不能表达报告基因。 质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 碱裂解法碱裂解法碱裂解法碱裂解法 沸水浴法沸水浴法沸水浴法沸水浴法 氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加加加加CsClCsCl和溴化乙锭和溴化乙锭和溴化乙锭和溴化乙锭超速离心过夜超速离心过夜超速离心过夜超速离心过夜proteinsproteinsocDNAocDNAL-DNAL-DNAcccDNAcccDNARNAsRNAs在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccDNAcccDNA沸水浴法沸水浴法沸水浴法沸水浴法 用含用含用含用含EDTAEDTA和和和和Triton X-100Triton X-100的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴40 40 secsec离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法碱裂解法碱裂解法将菌体悬浮在含将菌体悬浮在含将菌体悬浮在含将菌体悬浮在含EDTAEDTA的缓冲液中的缓冲液中的缓冲液中的缓冲液中加加加加NaOHNaOH与与与与SDSSDS混合液，去膜释放内含物混合液，去膜释放内含物混合液，去膜释放内含物混合液，去膜释放内含物加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加高浓度加高浓度加高浓度加高浓度NaAcNaAc溶液，沉淀去除染色体、大部分蛋白质溶液，沉淀去除染色体、大部分蛋白质溶液，沉淀去除染色体、大部分蛋白质溶液，沉淀去除染色体、大部分蛋白质离心取上清，酚离心取上清，酚离心取上清，酚离心取上清，酚- -氯仿处理，去除痕量蛋白质、核酸酶氯仿处理，去除痕量蛋白质、核酸酶氯仿处理，去除痕量蛋白质、核酸酶氯仿处理，去除痕量蛋白质、核酸酶乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒RNaseRNase处理残余处理残余处理残余处理残余RNARNA氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 质粒纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；质粒纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；质粒纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；质粒纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；碱裂解法碱裂解法碱裂解法碱裂解法 质粒纯度低、快速、操作简便；质粒纯度低、快速、操作简便；质粒纯度低、快速、操作简便；质粒纯度低、快速、操作简便；沸水浴法沸水浴法沸水浴法沸水浴法 质粒纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间。质粒纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间。质粒纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间。质粒纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间。（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒DNADNA 噬噬菌菌体体(bacteriophage)或或病病毒毒(virus)是是一一类类非非细细胞胞微微生生物物，能能高高效效率率高高特特异异性性地地侵侵染染宿宿主主细细胞胞，然然后后或或自自主主复复制制繁繁殖殖，或或整整合合入入宿宿主主基基因因组组中中潜潜伏伏起起来来，而而且且在在一一定定条条件件下下这两种状态会相互转化。这两种状态会相互转化。 噬菌体吸附噬菌体吸附在在E.coli上上噬菌体释放、噬菌体释放、菌体裂解菌体裂解T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体The DNA is about 3,500 times longer than the viral particle.The electron micrographof the single linear DNAmolecule of bacteriophage T2(about 182,000 bp); 可使外源基因高效导入受体细胞。可使外源基因高效导入受体细胞。可使外源基因高效导入受体细胞。可使外源基因高效导入受体细胞。可使外源基因在受体细胞中高效扩增。可使外源基因在受体细胞中高效扩增。可使外源基因在受体细胞中高效扩增。可使外源基因在受体细胞中高效扩增。 噬噬菌菌体体或或病病毒毒DNA能能被被开开发发为为基基因因工工程程载体的原因：载体的原因：高效感染性高效感染性高效感染性高效感染性 自主复制繁殖性自主复制繁殖性自主复制繁殖性自主复制繁殖性 E.coliE.coli的的的的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA生物结构：生物结构：生物结构：生物结构： -DNA-DNA为双链线性为双链线性为双链线性为双链线性DNADNA，长，长，长，长48.5 48.5 kbkb； 噬菌体是噬菌体是噬菌体是噬菌体是E.coliE.coli的温和型噬菌体；的温和型噬菌体；的温和型噬菌体；的温和型噬菌体； 噬菌体由外壳包装蛋白和噬菌体由外壳包装蛋白和噬菌体由外壳包装蛋白和噬菌体由外壳包装蛋白和 -DNA-DNA组成；组成；组成；组成； 噬菌体能包装原噬菌体能包装原噬菌体能包装原噬菌体能包装原 -DNA-DNA长度的长度的长度的长度的75-105%75-105%，约，约，约，约37-51kb37-51kb；cos位点位点对包装至关重要。对包装至关重要。 -DNA两两端端各各有有12个个核核苷苷酸酸组组成成的的5突突出出粘粘性末端性末端(cohensive-end)，5 5 TCCAGCGGCGGGGTCCAGCGGCGGGG3333CCCGCCGCTGGACCCGCCGCTGGA 5 5 -DNA 二二者者的的核核苷苷酸酸序序列列互互补补，进进入入宿宿主主细细胞胞后后，粘粘性性末末端端连连接接成成环环状状DNA分分子子，此末端称为此末端称为cos位点位点(cohensive-end site)。5 5 TCCAGCGGCGGGGTCCAGCGGCGGGG3333CCCGCCGCTGGACCCGCCGCTGGA 5 5 coscos位点位点位点位点头部合成基因头部合成基因头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNADNA合成控制基因合成控制基因合成控制基因合成控制基因阻遏基因阻遏基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因删除与整合基因删除与整合基因 - DNA - DNA48,502bpE.coli -DNA-DNA上至少有上至少有上至少有上至少有6161个基因个基因个基因个基因溶菌周期溶菌周期噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期溶源周期溶源周期烈性噬菌体烈性噬菌体(virulent phage)只有溶菌周期。只有溶菌周期。温温和和噬噬菌菌体体(temperate phage)既既有有溶溶源源周周期，又有溶菌周期。期，又有溶菌周期。1 1、溶菌周期：、溶菌周期：、溶菌周期：、溶菌周期：E.coliE.coli吸附吸附吸附吸附LamBLamB受体受体受体受体注入注入注入注入复制复制复制复制包装包装包装包装裂解裂解裂解裂解 感感染染细细菌菌后后，立立即即在在菌菌体体内内复复制制和和合合成成蛋蛋白白质质外外壳壳，重重新新组组装装成成噬噬菌菌体体颗颗粒粒，并并导导致致细细菌菌细细胞胞裂裂解，释放出大量子代噬菌体。解，释放出大量子代噬菌体。2、溶源周期：、溶源周期： 整整合合到到细细菌菌染染色色体体的的DNA随随细细菌菌染染色色体体复复制而复制。制而复制。 感感染染细细菌菌后后，将将自自己己的的DNA整整合合到到细细菌菌的的染染色色体体DNA中中，形形成成原原噬噬菌菌体体(prophage)，这这一一 过过 程程 称称 为为 溶溶 源源 化化(lysogenization)。 经经过过若若干干世世代代后后，才才从从细细菌菌染染色色体体上上脱脱离离下下来来，复复制制、合合成成噬噬菌菌体体蛋蛋白白，组组装装成成新新的的噬噬菌菌体体，导导致致菌菌体体细细胞胞裂解。裂解。 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体感感感感染染染染E.coliE.coli后后后后，除除除除能能能能裂裂裂裂解解解解细细细细胞胞胞胞（溶溶溶溶菌菌菌菌状状状状态态态态）外外外外，还还还还能能能能将将将将其其其其DNADNA整整整整合合合合到到到到宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞染染染染色色色色体体体体DNADNA上上上上，而而而而不不不不产产产产生生生生子子子子代代代代噬噬噬噬菌菌菌菌体颗粒，即体颗粒，即体颗粒，即体颗粒，即溶源状态溶源状态溶源状态溶源状态。 整整整整合合合合由由由由 -DNA-DNA上上上上cIcI和和和和intint基基基基因因因因的的的的产产产产物物物物激激激激活活活活，这这这这两两两两个个个个基基基基因因因因的的的的开开开开放放放放与与与与关关关关闭闭闭闭又又又又取取取取决决决决于于于于宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞本本本本身的性质。身的性质。身的性质。身的性质。 在在在在宿宿宿宿主主主主生生生生理理理理状状状状态态态态好好好好，即即即即营营营营养养养养条条条条件件件件适适适适合合合合、菌菌菌菌体体体体代代代代谢谢谢谢旺旺旺旺盛盛盛盛的的的的情情情情况况况况下下下下，cIcI基基基基因因因因关关关关闭闭闭闭，进进进进入入入入溶溶溶溶菌菌菌菌状状状状态态态态；在在在在宿宿宿宿主主主主生生生生理理理理状状状状态态态态差差差差的的的的情情情情况况况况下下下下，cIcI基基基基因因因因开开开开放放放放，进入溶源状态。进入溶源状态。进入溶源状态。进入溶源状态。DNADNA重组技术需重组技术需重组技术需重组技术需 噬菌体进入噬菌体进入噬菌体进入噬菌体进入 状态。状态。状态。状态。 可可可可根根根根据据据据需需需需要要要要，改改改改变变变变 -DNA-DNA或或或或宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞的的的的性性性性质质质质，使使使使噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体或或或或处处处处于于于于溶溶溶溶菌菌菌菌状状状状态态态态，或或或或处处处处于于于于溶溶溶溶源状态。源状态。源状态。源状态。溶菌溶菌溶菌溶菌感染早期：双链进行感染早期：双链进行 型复制。型复制。 -DNA的复制：的复制： 型复制型复制滚环复制滚环复制 感染晚期：启动滚环复制机制。感染晚期：启动滚环复制机制。形成多联体形成多联体 -DNA分子，必须在分子，必须在cos位点位点被切断成单体分子才能被包装。被切断成单体分子才能被包装。 -DNA-DNA载体的构建载体的构建载体的构建载体的构建 野野野野生生生生型型型型 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体能能能能包包包包装装装装原原原原 -DNA-DNA长长长长度度度度的的的的75-105%75-105%（37-5137-51kbkb），本本本本身身身身长长长长度度度度为为为为48.548.5kbkb， 只只只只有有有有当当当当插插插插入入入入的的的的外外外外源源源源DNADNA片片片片段段段段2.52.5kbkb时时时时，才才才才能能能能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。被包装成有感染力的噬菌体颗粒。被包装成有感染力的噬菌体颗粒。被包装成有感染力的噬菌体颗粒。 缩短野生型缩短野生型缩短野生型缩短野生型 -DNA-DNA长度，可提高装载量。长度，可提高装载量。长度，可提高装载量。长度，可提高装载量。1、缩短长度：、缩短长度：插入型载体插入型载体 取代型载体取代型载体根据切除的多少，将根据切除的多少，将根据切除的多少，将根据切除的多少，将 -DNA-DNA分成两类：分成两类：分成两类：分成两类： 野野野野生生生生型型型型 - -DNADNA上上上上约约约约40-50%40-50%的的的的片片片片段段段段是是是是复复复复制制制制和裂解所非必需的。和裂解所非必需的。和裂解所非必需的。和裂解所非必需的。 对某一限制酶只有单一切点，且通常只能用对某一限制酶只有单一切点，且通常只能用对某一限制酶只有单一切点，且通常只能用对某一限制酶只有单一切点，且通常只能用这一种限制酶，如这一种限制酶，如这一种限制酶，如这一种限制酶，如 gtgt系列。系列。系列。系列。体外包装体外包装体外包装体外包装插入位点插入位点插入位点插入位点载体长度：载体长度：载体长度：载体长度：37 37 kbkb体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段插入片段插入片段插入片段：插入片段：插入片段：插入片段：0-14 0-14 kbkb插入型载体插入型载体插入型载体插入型载体( (insertion vectors)insertion vectors)： 取代型载体取代型载体取代型载体取代型载体(substitution vectors)(substitution vectors)： 载体长度：载体长度：载体长度：载体长度：26 26 kbkb体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段插入片段插入片段 插入片段：插入片段：插入片段：插入片段：1 11-25 kb1-25 kb 含含含含某某某某一一一一限限限限制制制制酶酶酶酶的的的的两两两两个个个个切切切切点点点点，两两两两切切切切点点点点间间间间的的的的片片片片段段段段( (可置换区可置换区可置换区可置换区) )可被外源可被外源可被外源可被外源DNADNA替代，如替代，如替代，如替代，如 MBLMBL系列。系列。系列。系列。 取取代代型型载载体体的的2个个MCS区区以以反反向向重重复复形形式式位位于于 -DNA非非必必需需区区的的两两端端，通通过过酶酶切切，可可将将中中间间的的非非必必需区切下来，与用相同酶酶切的外源需区切下来，与用相同酶酶切的外源DNA置换。置换。2 2、删除重复的酶切位点、删除重复的酶切位点、删除重复的酶切位点、删除重复的酶切位点 同同同同时时时时，为为为为便便便便于于于于外外外外源源源源DNADNA的的的的克克克克隆隆隆隆，还还还还需需需需增增增增加加加加一些单一酶切位点。一些单一酶切位点。一些单一酶切位点。一些单一酶切位点。 野野野野生生生生型型型型 -DNA-DNA上上上上有有有有5 5个个个个EcoEcoR R I I、7 7个个个个HinHind d IIIIII位点，不利于重组操作，必须删除至位点，不利于重组操作，必须删除至位点，不利于重组操作，必须删除至位点，不利于重组操作，必须删除至1-21-2个。个。个。个。甲基化酶处理、定点突变。甲基化酶处理、定点突变。限制酶酶切；限制酶酶切；非必需区：非必需区：必需区：必需区：3 3 3 3、加装选择标记、加装选择标记、加装选择标记、加装选择标记野野野野生型生型生型生型 -DNA-DNA上缺少合适的选择标记。上缺少合适的选择标记。上缺少合适的选择标记。上缺少合适的选择标记。免疫功能类标记免疫功能类标记免疫功能类标记免疫功能类标记颜色反应类标记颜色反应类标记颜色反应类标记颜色反应类标记需在需在需在需在 -DNA-DNA非必需区加装选择标记：非必需区加装选择标记：非必需区加装选择标记：非必需区加装选择标记： 含含完完整整imm434基基因因的的 -DNA进进入入E.coli后后，建建立立溶溶源源状状态态，细细菌菌生生长慢，形成浑浊斑；长慢，形成浑浊斑；免疫功能类标记免疫功能类标记免疫功能类标记免疫功能类标记：imm434imm434 imm434编编码码阻阻止止 -噬噬菌菌体体进进入入溶菌循环的阻遏物。溶菌循环的阻遏物。 当当外外源源DNA插插入入imm434时时，基基因因灭灭活活，重重组组 -DNA进进入入溶溶菌菌循循环环，形成透明斑。形成透明斑。噬菌体感染细菌形成的噬菌斑噬菌体感染细菌形成的噬菌斑 空载体空载体 -DNA产生蓝色透明斑；产生蓝色透明斑；颜色反应类标记：颜色反应类标记：颜色反应类标记：颜色反应类标记：lacZlacZ lacZ基基因因编编码码 -半半乳乳糖糖苷苷酶酶，在在IPTG诱诱导导下下，能能催催化化无无色色底底物物X-gal生成蓝色化合物。生成蓝色化合物。 当当外外源源基基因因插插入入lacZ中中，基基因因灭灭活，不能生成蓝色化合物。活，不能生成蓝色化合物。4 4、构建琥珀型突变体、构建琥珀型突变体、构建琥珀型突变体、构建琥珀型突变体 是指是指是指是指CAG(GlnCAG(Gln) )向向向向UAG(stop)UAG(stop)的突变。的突变。的突变。的突变。 琥珀型突变琥珀型突变琥珀型突变琥珀型突变( (supsup) )： E.coliE.coli的的的的某某某某些些些些菌菌菌菌株株株株含含含含特特特特异异异异性性性性校校校校正正正正基基基基因因因因，其其其其编码产物编码产物编码产物编码产物- -校正校正校正校正tRNAtRNA能专一性纠正这一突变。能专一性纠正这一突变。能专一性纠正这一突变。能专一性纠正这一突变。 基基基基因因因因工工工工程程程程实实实实验验验验中中中中使使使使用用用用的的的的受受受受体体体体是是是是具具具具有有有有琥琥琥琥珀珀珀珀型型型型突突突突变体校正功能变体校正功能变体校正功能变体校正功能的菌株的菌株的菌株的菌株。 将将将将野野野野生生生生型型型型 -DNA-DNA上上上上D D和和和和E E两两两两个个个个头头头头部部部部包包包包装装装装蛋蛋蛋蛋白白白白的基因中的的基因中的的基因中的的基因中的CAGCAG密码子突变成密码子突变成密码子突变成密码子突变成UAGUAG。 当当当当这这这这种种种种 -DNA-DNA进进进进入入入入一一一一般般般般E.coliE.coli后后后后，不不不不能能能能合合合合成成成成有有有有活活活活性性性性的的的的头头头头部部部部蛋蛋蛋蛋白白白白，也也也也就就就就不不不不能能能能被被被被包包包包装装装装和和和和裂裂裂裂解解解解细细细细菌菌菌菌，从而阻止有害重组体的生物污染及扩散。从而阻止有害重组体的生物污染及扩散。从而阻止有害重组体的生物污染及扩散。从而阻止有害重组体的生物污染及扩散。 重重重重组组组组 -DNA-DNA需需需需在在在在体体体体外外外外人人人人工工工工包包包包装装装装成成成成有有有有感感感感染染染染力力力力的的的的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。重组重组重组重组 - -DNADNA的体外包装的体外包装的体外包装的体外包装 用用于于体体外外包包装装的的蛋蛋白白可可直直接接从从感感染染 噬噬菌菌体体的的E.coli中中提提取取，已已商商品品化化，通通常常为为互互补补的的两两部部分分：一一部部分分缺缺少少E组组份份，另另一一部部分分缺缺少少D组份。组份。-这是基于这是基于安全性安全性而设计而设计的。的。 任任何何一一种种蛋蛋白白包包装装液液被被重重组组 -DNA污污染染，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。 包包装装时时，当当且且仅仅当当这这两两部部分分包包装装蛋蛋白白与与重重组组 -DNA分子混合后，包装才能有效进行。分子混合后，包装才能有效进行。 -DNA-DNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化将将将将E.coliE.coli在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入加入加入加入 - -噬菌体悬浮液，噬菌体悬浮液，噬菌体悬浮液，噬菌体悬浮液，3737培养培养培养培养1 1hrhr用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养4-124-12hrhr（噬菌体颗粒密度达（噬菌体颗粒密度达1013-1014/L，E.coli完全裂解）完全裂解） 超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体 酚抽提，释放酚抽提，释放 -DNA 乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀 -DNA -DNA-DNA作为载体的特点：作为载体的特点：作为载体的特点：作为载体的特点：可在体外包装成噬菌体颗粒，高效感染可在体外包装成噬菌体颗粒，高效感染可在体外包装成噬菌体颗粒，高效感染可在体外包装成噬菌体颗粒，高效感染E.coliE.coli；装载容量大，最大装载容量大，最大装载容量大，最大装载容量大，最大25 25 kbkb； 筛选方便；筛选方便；筛选方便；筛选方便； 提取比质粒简便；提取比质粒简便；提取比质粒简便；提取比质粒简便； 适合外源基因的克隆和扩增，但不适合其表达。适合外源基因的克隆和扩增，但不适合其表达。适合外源基因的克隆和扩增，但不适合其表达。适合外源基因的克隆和扩增，但不适合其表达。E.coliE.coli的的的的M13M13单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体DNADNA生物结构：生物结构：生物结构：生物结构：外型呈丝状；外型呈丝状；外型呈丝状；外型呈丝状；由外壳包装蛋白和单股正链由外壳包装蛋白和单股正链由外壳包装蛋白和单股正链由外壳包装蛋白和单股正链DNADNA组成；组成；组成；组成； 基因组为基因组为基因组为基因组为单链线性单链线性单链线性单链线性DNADNA，长，长，长，长6.4 6.4 kbkb；DNADNA上至少有上至少有上至少有上至少有1010个基因，均为增殖所必需。个基因，均为增殖所必需。个基因，均为增殖所必需。个基因，均为增殖所必需。2,7002,700个外壳蛋白个外壳蛋白个外壳蛋白个外壳蛋白不裂解宿主细胞，但抑制其生长；不裂解宿主细胞，但抑制其生长；不裂解宿主细胞，但抑制其生长；不裂解宿主细胞，但抑制其生长； M13M13噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体M13M13的生活周期的生活周期的生活周期的生活周期注意：注意：虽不虽不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，为正常的为正常的1/2-3/4）。）。组装成新的噬菌体组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞，挤出寄主细胞M13通过雄性细菌的通过雄性细菌的F性须注入其性须注入其+DNA+DNA合成合成-DNA，形成双链，形成双链RF DNA复制复制+DNA，转录，转录mRNA、翻译形成噬菌体蛋白、翻译形成噬菌体蛋白+DNA+DNA注入注入E.coli+DNA指导合成指导合成M13外壳蛋白外壳蛋白转录转录翻译翻译mRNA复制复制+DNA200个个RF DNA- DNA（每个细胞可释放约（每个细胞可释放约1000个个M13颗粒）颗粒）组装成子代组装成子代M13 M13基基因因组组中中只只有有基基因因II和和IV之之间间存存在在一一段段507bp的的基因间隔区基因间隔区(intergenic region, IG区区)。 该该区区存存在在M13的的ori，插插入入外外源源DNA而而不不影影响响M13噬菌体的活力，可作为克隆区。噬菌体的活力，可作为克隆区。M13 DNAM13 DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：III VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIII野生型野生型野生型野生型M13 RF-DNAM13 RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13 mpM13 mp系列载体系列载体系列载体系列载体lacZlacZ polylinkerpolylinkerIGIG区内只有区内只有1个个Bsu I 切点切点M13mp18的多克隆位点与的多克隆位点与pUC18相同相同M13 DNAM13 DNA载体的特点：载体的特点：载体的特点：载体的特点：克隆的克隆的克隆的克隆的DNADNA以单链形式输出以单链形式输出以单链形式输出以单链形式输出E.coliE.coli，便于测序；，便于测序；，便于测序；，便于测序；M13M13重组子筛选简便；重组子筛选简便；重组子筛选简便；重组子筛选简便； 最大缺陷是装载量小，仅最大缺陷是装载量小，仅最大缺陷是装载量小，仅最大缺陷是装载量小，仅1.5 1.5 kbkb。被被M13感感染染的的受受体体菌菌生生长长缓缓慢慢，形形成成混混浊浊斑斑；重组重组DNA越大，混浊斑的混浊度越大。越大，混浊斑的混浊度越大。动植物病毒动植物病毒动植物病毒动植物病毒DNADNA单链单链单链单链DNADNA病毒病毒病毒病毒双链双链双链双链DNADNA病毒病毒病毒病毒单链单链单链单链RNARNA病毒病毒病毒病毒双链双链双链双链RNARNA病毒病毒病毒病毒按基因组结构，将动植物病毒分成四类：按基因组结构，将动植物病毒分成四类：按基因组结构，将动植物病毒分成四类：按基因组结构，将动植物病毒分成四类： 动植物病毒克隆载体动植物病毒克隆载体动植物病毒克隆载体动植物病毒克隆载体双链双链DNA病毒：如花椰菜花叶病毒病毒：如花椰菜花叶病毒(CaMV)单链单链DNA病毒：如番茄金黄花叶病毒病毒：如番茄金黄花叶病毒(TGMV)RNA病毒：如雀麦草花叶病毒病毒：如雀麦草花叶病毒(TMV)用于构建克隆载体的植物病毒：用于构建克隆载体的植物病毒： RNA RNA病毒在自我复制时大多存在相应的病毒在自我复制时大多存在相应的病毒在自我复制时大多存在相应的病毒在自我复制时大多存在相应的DNADNA中间体中间体中间体中间体，可作为载体进行常规的，可作为载体进行常规的，可作为载体进行常规的，可作为载体进行常规的DNADNA重组。重组。重组。重组。常用的动物病毒载体常用的动物病毒载体 腺病毒腺病毒腺相关病毒腺相关病毒逆转录病毒逆转录病毒慢病毒慢病毒改造的猴肾病毒改造的猴肾病毒SV40痘苗病毒痘苗病毒疱疹病毒疱疹病毒昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒应用动物病毒弱毒或无毒株应用动物病毒弱毒或无毒株: （四）考斯质粒与噬菌粒（四）考斯质粒与噬菌粒（四）考斯质粒与噬菌粒（四）考斯质粒与噬菌粒 -DNA和和M13-DNA载载体体的的最最大大装装载载量量分分别别为为25kb和和1.5kb，但但很很多多情情况况下下，往往往往需需要要克隆更大的外源克隆更大的外源DNA片段。片段。 考斯质粒和噬菌粒的构建就是为了进一步考斯质粒和噬菌粒的构建就是为了进一步考斯质粒和噬菌粒的构建就是为了进一步考斯质粒和噬菌粒的构建就是为了进一步提高噬菌体提高噬菌体提高噬菌体提高噬菌体DNADNA的装载量。的装载量。的装载量。的装载量。 -构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。 在在包包装装上上限限固固定定的的条条件件下下，大大幅幅度度缩缩短短噬噬菌菌体体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。的长度，就能同步增加载体的装载能力。 将将噬噬菌菌体体DNA包包装装有有关关序序列列与与质质粒粒组组装装在在一一起起，既既能能缩缩短短载载体体长长度度、提提高高装装载载量量，又又能能保保证证重组重组DNA在体外仍被包装成有感染性的颗粒。在体外仍被包装成有感染性的颗粒。 由由于于考考斯斯质质粒粒和和噬噬菌菌粒粒不不携携带带包包装装蛋蛋白白基基因因，因因此此重重组组DNA分分子子在在细细胞胞内内不能形成噬菌体颗粒。不能形成噬菌体颗粒。考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（CosmidCosmid）coscospHC79pHC796.4 kb6.4 kbTetTetrr包装相关包装相关包装相关包装相关序列序列序列序列orioriAmpAmprrPstPst I IBamBamHH I ISalSal I I19781978年，年，年，年， B.B.HHohnohn J.J.CCollins ollins 发明构建发明构建发明构建发明构建考考考考斯斯斯斯质质质质粒粒粒粒：是是是是一一一一类类类类人人人人工工工工构构构构建建建建的的的的含含含含有有有有 -DNA-DNA的的的的coscos序序序序列列列列、包包包包装装装装相相相相关关关关序序序序列列列列 + + pBR322pBR322质质质质粒粒粒粒的的的的复复复复制制制制子子子子、克克克克隆隆隆隆位位位位点点点点、标标标标记记记记基基基基因因因因的的的的特特特特殊殊殊殊类类类类型型型型载体；载体；载体；载体；1.8 1.8 kbkb的的的的 -DNA-DNA片段片段片段片段+ +pBR322pBR322片段；片段；片段；片段；6.4 6.4 kbkb，装载范围为装载范围为装载范围为装载范围为31-45 31-45 kbkb。cos site - carrying plasmid；考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：能像能像能像能像 -DNA-DNA那样进行体外包装，并高效转染那样进行体外包装，并高效转染那样进行体外包装，并高效转染那样进行体外包装，并高效转染E.coliE.coli；装载量大（装载量大（装载量大（装载量大（45 45 kbkb）；能像质粒那样在能像质粒那样在能像质粒那样在能像质粒那样在E.coliE.coli中自主复制；中自主复制；中自主复制；中自主复制；制备与质粒相同，制备与质粒相同，制备与质粒相同，制备与质粒相同，重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易；与与与与 -DNA-DNA不同：不能体内包装，不裂解不同：不能体内包装，不裂解不同：不能体内包装，不裂解不同：不能体内包装，不裂解E.coliE.coli。Cosmid克隆的过程克隆的过程用用CIP去去除除线线性性载载体体的的5-P，可可防止载体自连。防止载体自连。?噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（phagemidphagemid） 是是是是一一一一类类类类人人人人工工工工构构构构建建建建的的的的含含含含单单单单链链链链噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体包包包包装装装装序序序序列列列列、复复复复制制制制子子子子和和和和质质质质粒粒粒粒复复复复制制制制子子子子、克克克克隆隆隆隆位位位位点点点点、标记基因的特殊类型载体。标记基因的特殊类型载体。标记基因的特殊类型载体。标记基因的特殊类型载体。噬菌粒的特点：噬菌粒的特点：噬菌粒的特点：噬菌粒的特点：能像能像能像能像M13-DNAM13-DNA那样体外包装，并高效转染那样体外包装，并高效转染那样体外包装，并高效转染那样体外包装，并高效转染E.coliE.coli；装载量比装载量比装载量比装载量比M13mpM13mp系列大得多系列大得多系列大得多系列大得多（10 10 kbkb）；能像质粒那样在能像质粒那样在能像质粒那样在能像质粒那样在E.coliE.coli中自主复制；中自主复制；中自主复制；中自主复制；重组操作简便，筛选容易。重组操作简便，筛选容易。重组操作简便，筛选容易。重组操作简便，筛选容易。通过克隆双链通过克隆双链通过克隆双链通过克隆双链DNADNA，能获得同等长度的单一单链，能获得同等长度的单一单链，能获得同等长度的单一单链，能获得同等长度的单一单链DNADNA；重要的噬菌粒载体重要的噬菌粒载体重要的噬菌粒载体重要的噬菌粒载体pUC118/119 =pUC118/119 = pUC18/19 pUC18/19的的的的oriori、AmpAmprr、lacZlacZ 、MCSMCS + + M13M13-IG-IG、oriori 3200 3200 bpbpMCSMCSlacZlacZlacIlacIorioriAmpAmprrM13-IGM13-IGpUC118/119pUC118/119pUC118/119pUC118/119：1 1）双链质粒复制模式）双链质粒复制模式）双链质粒复制模式）双链质粒复制模式 在在宿宿主主细细胞胞没没有有感感染染上上M13辅辅助助噬噬菌菌体体时时，受受pUC本本身身的的复复制制起起点点控控制制，每每个个细细胞胞能达能达500个拷贝。个拷贝。500 500 个拷贝个拷贝个拷贝个拷贝2 2）单链噬菌体滚环复制模式）单链噬菌体滚环复制模式）单链噬菌体滚环复制模式）单链噬菌体滚环复制模式 当当宿宿主主细细胞胞被被M13辅辅助助噬噬菌菌体体感感染染后后，受受M13的的复复制制起起点点控控制制，按按单单链链噬噬菌菌体体滚滚环复制模式复制。环复制模式复制。表示表示表示表示M13M13辅助噬菌体辅助噬菌体辅助噬菌体辅助噬菌体DNADNA辅助噬菌体：辅助噬菌体： 自自身身ori突突变变、复复制制效效率率低低，但但感感染染宿宿主主细细胞胞后后，能能表表达达出出外外壳壳蛋蛋白白和和复复制制蛋蛋白白，帮帮助助噬菌粒载体复制，如噬菌粒载体复制，如M13K07。表示表示表示表示M13M13辅助噬菌体辅助噬菌体辅助噬菌体辅助噬菌体DNADNA3 3）噬菌粒载体的包装）噬菌粒载体的包装）噬菌粒载体的包装）噬菌粒载体的包装 高效复制的噬菌粒单链高效复制的噬菌粒单链DNA被包装成被包装成噬菌体颗粒，被挤出宿主细胞外。噬菌体颗粒，被挤出宿主细胞外。表示表示表示表示M13M13辅助噬菌体辅助噬菌体辅助噬菌体辅助噬菌体DNADNA人工染色体载体人工染色体载体人工染色体载体人工染色体载体 人人类类、动动物物、植植物物的的全全基基因因组组序序列列分分析析需需克克隆隆数数百百甚甚至至上上千千kb DNA片片段段，此此时时考考斯斯质质粒粒和和噬噬菌菌粒粒载载体体的的装装载载量量远远不不能能满满足需要。足需要。 细菌人工染色体细菌人工染色体细菌人工染色体细菌人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体 将将细细菌菌接接合合因因子子或或酵酵母母染染色色体体的的复复制制区区、分分配配区区、稳稳定定区区与与质质粒粒组组装装在在一一起起，即即构构成成人人工染色体载体工染色体载体(artificial chromosome)。 当当大大片片段段外外源源DNA克克隆隆在在人人工工染染色色体体载载体体上上，便便形形成成重重组组人人工工染染色色体体，它它能能像像天天然然染染色色体体那那样样，在在受受体体细细胞胞中中稳稳定定复复制并遗传。制并遗传。 细菌人工染色体细菌人工染色体细菌人工染色体细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BACbacterial artificial chromosome, BAC） 19921992年年年年，H.ShizuyaH.Shizuya等等等等在在在在E.coliE.coli性性性性因因因因子子子子-F-F质粒的基础上构建的，装载量质粒的基础上构建的，装载量质粒的基础上构建的，装载量质粒的基础上构建的，装载量50-30050-300kbkb； BAC BAC在在在在E.coliE.coli受体菌中只能维持受体菌中只能维持受体菌中只能维持受体菌中只能维持单一拷贝单一拷贝单一拷贝单一拷贝。装载量大，为装载量大，为300 kb；BAC的特点：的特点：单拷贝复制；单拷贝复制；可以像提取质粒一样直接提取克隆的可以像提取质粒一样直接提取克隆的DNA。在细菌细胞中扩增；在细菌细胞中扩增；CMR：氯霉素抗性基因；：氯霉素抗性基因；parA、parB：控制拷贝数；：控制拷贝数；oriS、repE：复制起点，控：复制起点，控制质粒单向复制；制质粒单向复制；oriS、repE、parA、parB来来自性因子；自性因子；Not I：用于切下外源：用于切下外源DNA。Hind III和和BamH I：克隆位点；：克隆位点；BAC的组成：的组成：BACBAC主要适用于：主要适用于：主要适用于：主要适用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clustergene cluster）；构建动植物基因文库（构建动植物基因文库（构建动植物基因文库（构建动植物基因文库（gene library or gene library or gene bankgene bank）。）。）。）。 酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome, YACyeast artificial chromosome, YAC）1983年，年，A.W.Murray形成基础理论；形成基础理论；1987年，年，D.T.Burke构建。构建。按染色体结构构建；按染色体结构构建；特点：特点：在酵母细胞中扩增。在酵母细胞中扩增。装载量大，为装载量大，为350-400kb；染色体复制和遗传的三个基本组件：染色体复制和遗传的三个基本组件：DNA复制起始点（复制起始点（ori）着丝粒（着丝粒（centromere）两个端粒（两个端粒（telomeres）YACYAC载体应含有下列元件：载体应含有下列元件：载体应含有下列元件：载体应含有下列元件： 酵母染色体的复制起点酵母染色体的复制起点酵母染色体的复制起点酵母染色体的复制起点ARSARS酵母染色体的酵母染色体的酵母染色体的酵母染色体的着丝粒着丝粒着丝粒着丝粒CEN4CEN4酵母染色体酵母染色体酵母染色体酵母染色体的端粒的端粒的端粒的端粒TELTEL酵母筛选标记酵母筛选标记酵母筛选标记酵母筛选标记TRP1TRP1酵母筛选标记酵母筛选标记酵母筛选标记酵母筛选标记URA3URA3E.coliE.coli的复制起点的复制起点的复制起点的复制起点orioriE.coliE.coli的选择标记的选择标记的选择标记的选择标记AmpAmprrCEN4CEN4pYAC4pYAC4EcoEcoRR I IURA3URA3TELTELBamBamHH I ITELTELorioriAmpAmprrTRP1TRP1ARS1ARS1TRP1：色氨酸生物合成基因色氨酸生物合成基因URA3：尿嘧啶生物合成基因尿嘧啶生物合成基因YACYAC载体的使用：载体的使用：载体的使用：载体的使用：pYAC4pYAC4CENCENEcoEcoRR I IURAURATELTELBamBamHH I ITELTELorioriAmpAmprrTRPTRPARSARSEcoEcoRR I IEcoEcoRR I IEcoEcoRR I IBamBamHH I I连接连接连接连接转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染色体重组酵母染色体重组酵母染色体几种载体的最大装载量：几种载体的最大装载量：几种载体的最大装载量：几种载体的最大装载量：15 kb25 kb45 kb300 kb400 kbplasmid -DNA Cosmid BACYAC构建其构建其构建其构建其cDNAcDNA文库：文库：文库：文库：构建其基因组文库：构建其基因组文库：构建其基因组文库：构建其基因组文库：构建动、植物和人类大型基因组文库：构建动、植物和人类大型基因组文库：构建动、植物和人类大型基因组文库：构建动、植物和人类大型基因组文库：绝大多数真核生物绝大多数真核生物绝大多数真核生物绝大多数真核生物mRNAmRNA 10 10 kbkb：载体常选载体常选 -DNA、Cosmid；载体选载体选plasmid；载体选载体选载体选载体选BACBAC或或或或YACYAC。