1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序u目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u目的基因的获取目的基因的获取u基因表达载体的构建基因表达载体的构建u将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1 1、原核细胞的基因结构、原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启启动子：子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，片断，它是它是RNA聚合聚合酶识别和和结合的部位，有了它才能合的部位，有了它才能驱动基因基因转录出出mRNA，最，最终获得蛋白得蛋白质终止子：止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，片断，能能终止止mRNA的的转录RNARNA聚合酶聚合酶: :能够识别启动子上结合位点的一种能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质蛋白质. . RNA RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。并与其结合。 转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并分子移动，并以以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。 转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚聚合酶也从合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列苷酸序列. .包括启动子和终止子包括启动子和终止子2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区内含子内含子 外显子外显子 转录转录mRNAmRNA前体前体加工加工翻译翻译肽链肽链启动子启动子终止子终止子成熟成熟mRNAmRNA能够编码蛋白质的序列。能够编码蛋白质的序列。 不能够编码蛋白质的序列。不能够编码蛋白质的序列。 外显子外显子: : 内含子内含子: : 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点（启动子）。聚合酶结合位点（启动子）。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的3 3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较、原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码1 1、什么是目的基因？、什么是目的基因？2 2、获取目的基因的方法有哪些？其操、获取目的基因的方法有哪些？其操作过程分别是怎样的？作过程分别是怎样的？请阅读请阅读P9P9第一和二第一和二两段两段1 1、目的基因概念：、目的基因概念： 主要指的是主要指的是编码蛋白质的结构基因。编码蛋白质的结构基因。也也可以是一些具有调控作用的因子。可以是一些具有调控作用的因子。2 2、目的基因获取方法：、目的基因获取方法：、从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因、利用利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因、化学方法直接化学方法直接人工合成人工合成、从、从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库基因文库的构建过程基因文库的构建过程限制酶限制酶拼接到载体上拼接到载体上导入受体细胞扩增导入受体细胞扩增将含有某种生物将含有某种生物不同基因的许多不同基因的许多DNADNA片断片断, ,导入到导入到受受受受体菌的群体体菌的群体体菌的群体体菌的群体中中, ,各各个受体菌分别含有个受体菌分别含有这种生物的不同基这种生物的不同基因因, ,称为基因文库。称为基因文库。基因组文库基因组文库cDNAcDNA文库的构建文库的构建-反转录法：反转录法： 以目的基因以目的基因转录成的信使成的信使RNA为模板，模板，反反转录成互成互补的的单链DNA，然后在，然后在酶的作的作用下合成双用下合成双链DNA，从而从而获得所需的基因。得所需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA反反转录酶DNA聚合聚合酶双链双链DNADNA( (目的基因目的基因) )基因文库的构建过程基因文库的构建过程真核生物的基因用逆转录法得到真核生物的基因用逆转录法得到的的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？原核生物基因呢？思考？思考？基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较怎样从基因文库中得到我怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢们所需的目的基因呢? ?如何从基因文库中找到所需要的基因？如何从基因文库中找到所需要的基因？依据依据-目的基因的有关信息。目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。构建基因组构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的文库时，首先应分离细胞的A、染色体、染色体DNAB、线粒体、线粒体DNAC、总、总mRNAD、tRNA目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生片段，导入某个生物物体内，则这个生物就是一个基因文库体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文文库库AC、利用利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因PCRPCR的全称：的全称： 聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR的原理：的原理： DNADNA复制复制 PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因的前提条件：的前提条件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。选修选修3、P58模板模板原料原料引物引物 酶酶控制温度控制温度利用利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因目的基因目的基因DNADNA四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸如单链如单链DNADNA分子片段，使分子片段，使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3 3端开始连端开始连接脱氧核苷酸接脱氧核苷酸耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR仪自动调控仪自动调控PCRPCR的条件：的条件：过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：）：双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：）：系统温度降低，系统温度降低，引物引物与与DNADNA模模板结合，形成局部板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模板的作用下，合成与模板互补的互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.重复步骤：每重复一次，目重复步骤：每重复一次，目的基因增加的基因增加_倍倍 一一1.加热至加热至95摄氏度的目的是使摄氏度的目的是使DNA中的中的断裂，这一过程在细胞内是通过断裂，这一过程在细胞内是通过的的作用来完成的。作用来完成的。2.当温度降低时，引物与模板末端结合，在当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成后合成2个个DNA分子，此过程中的原料分子，此过程中的原料是是，遵循的原则是，遵循的原则是。3.Taq酶的特点是（酶的特点是（）A.耐强酸耐强酸B.耐强碱耐强碱C.耐高温耐高温D.最适温度最适温度37摄氏度摄氏度4.请指出请指出PCR技术与技术与DNA复制过程的区别复制过程的区别解旋酶解旋酶C脱氧核苷酸脱氧核苷酸碱基互补配对原则碱基互补配对原则DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋变复制边解旋变复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶、聚合酶、解旋酶、解旋酶、DNA连接酶等连接酶等用化学方法直接用化学方法直接人工合成人工合成条件：条件：基因基因较小较小，核苷酸序列，核苷酸序列已知已知。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测化学法合成的目化学法合成的目的基因含的基因含内含子、启内含子、启动子和终止子动子和终止子吗？吗？反转录法反转录法目的基因的信使目的基因的信使RNARNA目的基因目的基因化学合成法化学合成法肽链氨基酸序列肽链氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因合成合成人工合成法（人工合成法（真核生物真核生物）推测推测推测推测单链单链DNADNA合成合成2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A. B. C. D.A. B. C. D.1在已知在已知基因的核苷酸基因的核苷酸序列的情况下，获取目的序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是基因的最方便方法是A、化学合成法、化学合成法B、基因组文库法、基因组文库法C、CDNA文库法文库法D、聚合酶链反应、聚合酶链反应3 3、 在基因工程中，把选出的一个目的基因（共在基因工程中，把选出的一个目的基因（共10001000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460460个）放入个）放入DNADNA扩增仪中扩增扩增仪中扩增4 4次，那么，在扩增次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ ）个）个A.540B.8100C.17280D.75604 4、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNADNA分分子片段为子片段为ATGTGATGTGTACACTACAC，要使其数量增多，可用，要使其数量增多，可用PCRPCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链双链DNADNA分子为模板分子为模板 ATGTGATGTG或或TACACTACAC模板链模板链 四四种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸 四种核苷酸四种核苷酸 DNADNA聚合酶聚合酶 热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶引物引物 温度变化温度变化 恒温恒温A A B BC C D DD5、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因利用利用PCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因反转录法反转录法通过通过DNA合成仪利合成仪利用化学方法人工合成用化学方法人工合成ABC DD（1 1）用一定的）用一定的_切切割质粒，使其出现一个切口，割质粒，使其出现一个切口，露出露出_。（2 2）用）用_ _ _切断切断目的基因，使其产生目的基因，使其产生_ _ _。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1.1.过程过程: :二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同一种同一种2 2、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成目的基因目的基因启动子启动子:终止子终止子:标记基因等标记基因等一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNADNA片段片段。位于基因的首端。位于基因的首端。一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNADNA片段片段。位于基因的尾端。位于基因的尾端。启动子的作用：启动子的作用：终止子作用：终止子作用：使转录在所需要的地方停止使转录在所需要的地方停止。标记基因作用：标记基因作用：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如青霉素基因。青霉素基因。 是是RNARNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位，有了它才，有了它才能驱动基因转录出能驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质。，最终获得蛋白质。3 3、基因表达载体的构建目的：、基因表达载体的构建目的：a.a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。并且可以遗传给下一代。b.b.使目的基因能够表达和发挥作用。使目的基因能够表达和发挥作用。思考：思考：作为基因工程表达载体，只需作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？什么？不可以。因不可以。因为目的基因在表达目的基因在表达载体中得到表达并体中得到表达并发挥作用，作用，还需要有其他控制元件，如启需要有其他控制元件，如启动子、子、终止子和止子和标记基因等。基因等。必必须构建上述元件的主要理由是：构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启的启动子才能比子才能比较有利于基因的表达；有利于基因的表达；（2） 通通过cDNA文文库获得的目的基因没有启得的目的基因没有启动子，只将子，只将编码序列序列导入受体生物中无法入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否目的基因是否导入受体生物中需要有入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增了增强目的基因的表达水平，往往目的基因的表达水平，往往还要增加一些其要增加一些其他他调控元件，如增控元件，如增强子等；子等；（5） 有有时需要确定目的基因表达的需要确定目的基因表达的产物存在于物存在于细胞的什么胞的什么部位，往往要加上可以部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基存在部位的基因（或做成目的基因与因与标识基因的融合基因），如基因的融合基因），如绿色色荧光蛋白基因等。光蛋白基因等。载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意 目的基因与运载体结合所需的条件有目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶同一种限制酶 具有抗性基因的质粒具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶聚合酶 目的基因目的基因 DNA连接酶连接酶 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 ATP A BC D（多选）一个基因表达载体的构建应包括（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因目的基因B启动子启动子C终止子终止子D标记基因标记基因ABCDD下列关于基因表达载体的叙述不正确的下列关于基因表达载体的叙述不正确的是是A启动子是与启动子是与RNA聚合酶识别和结合的聚合酶识别和结合的部位，是起始密码部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对短片段，对mRNA的转录起调控作用的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别入方式不同而有所差别A 1 1、什么是转化？、什么是转化？ 2 2、目的基因导入植物细胞常用的方法、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？是什么？具体过程是怎样的？ 3 3、目的基因导入动物细胞常用的方法、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？是什么？基本操作程序是怎样的？ 4 4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？样的？钙离子有什么作用？转化转化目的基因目的基因进入进入受体细胞内，并且受体细胞内，并且在受体细胞内在受体细胞内维持稳定和表达维持稳定和表达的的过程。过程。常用的受体细胞：常用的受体细胞：原核生物：大肠杆菌、原核生物：大肠杆菌、 枯草杆菌枯草杆菌 、土壤农杆菌、土壤农杆菌真核生物：酵母菌和动植物细胞真核生物：酵母菌和动植物细胞将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。1.1.目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞常用的方法常用的方法: :农杆菌转化法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、基因枪法、花粉管通道法农杆菌的特点农杆菌的特点: :c.Tic.Ti质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可转移到受体细胞，可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。b.b.具有趋化性。具有趋化性。a.a.易感染双子叶植物和祼子植物。易感染双子叶植物和祼子植物。（ 1） 、 农农 杆杆 菌菌 转转 化化 法法整合整合到染色体上到染色体上转移转移至受体细胞至受体细胞 根据农杆菌可将目的基因导入双子根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物若想将一个抗病基因导入单子叶植物( (如小麦），从理论上说，你认为应该如小麦），从理论上说，你认为应该怎么做？怎么做？P15-2因为单子叶植物不能分泌出大量的酚类化合物来吸引农杆菌，向单子叶植物的伤口处喷洒酚类化合物，使用基因枪法及花粉管道法。 （2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。1、常用于单子叶植、常用于单子叶植物的转化方法物的转化方法2、特点：成本高、特点：成本高（3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。我国转我国转我国转我国转基因抗基因抗基因抗基因抗虫棉就虫棉就虫棉就虫棉就是用这是用这是用这是用这种方法种方法种方法种方法获得获得获得获得. .目的基因导入动物细胞目的基因导入动物细胞常用的方法常用的方法: : 显微注射技术显微注射技术操作程序：操作程序：a.a.先提纯含目的基因的表达载体先提纯含目的基因的表达载体 b.b.从雌性动物体内取出卵（受精卵）从雌性动物体内取出卵（受精卵）c.c.显微注射仪进行显微注射显微注射仪进行显微注射 d.d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体子宫中发育成新个体常用法：常用法：CaCa2+2+处理处理常用菌：常用菌：大肠杆菌大肠杆菌3.3.目的基因导入微生物细胞目的基因导入微生物细胞原核生物的特点原核生物的特点: :繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。大肠杆菌的转化过程大肠杆菌的转化过程: :用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞重组表达重组表达载体载体DNADNA分子与感受态细胞混合分子与感受态细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNADNA分子。分子。增加细胞壁的透性，增加细胞壁的透性，与细胞膜无关与细胞膜无关 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞转化转化农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理处理植物基因植物基因工程工程动物基因动物基因工程工程微生物基微生物基因工程因工程常用方法常用方法受体细胞受体细胞比较目的基因导入不同细胞的方法比较目的基因导入不同细胞的方法农杆菌转农杆菌转化法化法显微注显微注射法射法Ca2+处处理法理法体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是为受体细胞，原因是A结构简单、操作方便结构简单、操作方便B繁殖速度快繁殖速度快C遗传物质含量少、简单遗传物质含量少、简单D性状稳定、变异少性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有、基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌枯草杆菌支原体支原体动植物细胞动植物细胞ABCDBD1 1、导入目的基因后需要检测哪些方面？、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？各采取什么方法？2 2、什么是、什么是DNADNA分子探针？检测时的分子探针？检测时的DNADNA探探针通过什么原理来检测目的基因和相针通过什么原理来检测目的基因和相应的应的mRNAmRNA？3 3、利用抗体抗原杂交检测的原理是什、利用抗体抗原杂交检测的原理是什么？么？检测内容检测内容检测方法检测方法1.1.目的基因是否插入受目的基因是否插入受体细胞染色体的体细胞染色体的DNADNA上上2.2.目的基因是否转录出目的基因是否转录出mRNAmRNA3.3.目的基因是否翻译出目的基因是否翻译出蛋白质蛋白质4 4、个体生物学水平的鉴、个体生物学水平的鉴定定分子杂交技术分子杂交技术抗原抗原抗体杂交抗体杂交DNADNA分子杂交技术分子杂交技术抗虫鉴定、抗病鉴抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等定、活性鉴定等DNADNA探针：探针： 用放射性同位素等作标记的含有目的基用放射性同位素等作标记的含有目的基因的因的DNADNA片段。片段。（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 ( (关键步骤关键步骤) ).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位片段用放射性同位素等作标记素等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 P P1515思考与探究思考与探究（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分子杂交法分子杂交法方法方法: :抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是道。下列属于目的基因检测和鉴定的是检测受体细胞中是否有目的基因检测受体细胞中是否有目的基因检测受检测受体细胞中是否有致病基因体细胞中是否有致病基因检测目的基因是否检测目的基因是否转录出转录出mRNA检测目的基因是否翻译出蛋白检测目的基因是否翻译出蛋白质质ABCDC2、基因工程是在、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因人工合成基因 B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C归纳: 基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、农杆菌转化法、显微注射法、 Ca2+处理处理4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：