放射自显影核医学教研室n n定义：定义：放射自显影是一种利用放射性核素发放射自显影是一种利用放射性核素发射的射线，使乳胶中的卤化银感光而形成潜射的射线，使乳胶中的卤化银感光而形成潜影，经显影和定影，形成图像。借助感光银影，经显影和定影，形成图像。借助感光银颗粒所在的部位和强度，通过影像分析，能颗粒所在的部位和强度，通过影像分析，能准确地判断放射性示踪剂的分布部位和数量准确地判断放射性示踪剂的分布部位和数量（半定量），这种技术称为（半定量），这种技术称为放射自显影术放射自显影术（autoradiography）。）。这种技术得到的图这种技术得到的图像称为像称为放射自显影像放射自显影像（autoradiogram），），以上两种术语均可简称为以上两种术语均可简称为放射自显影放射自显影（ARG）。）。第一节 基本原理一、潜影的形成和消退一、潜影的形成和消退二、类型二、类型三、常用的感光材料三、常用的感光材料四、常用的放射性核素四、常用的放射性核素五、照相处理五、照相处理六、放射自显影的分辨力六、放射自显影的分辨力七、放射自显影的本底、效率七、放射自显影的本底、效率一、潜影的形成和消退一、潜影的形成和消退n（一）潜影形成的原理（一）潜影形成的原理n n放射自显影原理与光学摄影原理基本相似。放射自显影原理与光学摄影原理基本相似。乳胶中的每颗溴化银晶体都是由乳胶中的每颗溴化银晶体都是由Ag+和和Br-的点阵构成。在制作过程中，点阵存在缺的点阵构成。在制作过程中，点阵存在缺陷，这些缺陷即是潜影形成过程中的敏化陷，这些缺陷即是潜影形成过程中的敏化中心。射线与乳胶相互作用，引起电离作中心。射线与乳胶相互作用，引起电离作用，使用，使Ag+还原为还原为Ag原子，形成潜影。原子，形成潜影。潜影形成步骤潜影形成步骤 1 1、发射电子、发射电子、发射电子、发射电子：核射线与溴化银作用，使其电离，射核射线与溴化银作用，使其电离，射核射线与溴化银作用，使其电离，射核射线与溴化银作用，使其电离，射出电子，向敏化中心移动形成阴电层。出电子，向敏化中心移动形成阴电层。出电子，向敏化中心移动形成阴电层。出电子，向敏化中心移动形成阴电层。 AgBrAgBr+ + 粒子粒子粒子粒子AgAg+ +Br+Br- -+e+e- - 2 2 2 2、 AgAg+ +的的的的还还原：原：原：原：AgAgAgAg+ + + +向敏化中心移动，与向敏化中心移动，与向敏化中心移动，与向敏化中心移动，与e-e-e-e-结合，还结合，还结合，还结合，还原成银原子。原成银原子。原成银原子。原成银原子。 e e- -+Ag+Ag+ + Ag Ag 3 3 3 3、潜影形成：潜影形成：潜影形成：潜影形成：还原的银原子起催化作用，致周围的还原的银原子起催化作用，致周围的还原的银原子起催化作用，致周围的还原的银原子起催化作用，致周围的AgAgAgAg+ + + +被还被还被还被还原，形成潜影。原，形成潜影。原，形成潜影。原，形成潜影。 Ag Ag Ag Ag nAgnAg 潜影经显影液和定影液处理即成为自显影图像。潜影经显影液和定影液处理即成为自显影图像。潜影经显影液和定影液处理即成为自显影图像。潜影经显影液和定影液处理即成为自显影图像。（二）潜影的消退（二）潜影的消退n n有潜影形成的结晶在显影液的作用下，溴有潜影形成的结晶在显影液的作用下，溴被洗去，银原子则留下来成一个黑色颗粒。被洗去，银原子则留下来成一个黑色颗粒。潜影如未及时显影，则在水、氧等作用下潜影如未及时显影，则在水、氧等作用下还原的银原子会减少，使潜影消退。故曝还原的银原子会减少，使潜影消退。故曝光应在光应在干燥、低温、少氧干燥、低温、少氧的环境下进行。的环境下进行。二、放射自显影的类型二、放射自显影的类型n n（一）宏观自显影（一）宏观自显影（macroscopic ARG）：又称大体自显影，观察范围较大，分辨力又称大体自显影，观察范围较大，分辨力低，只能供肉眼或放大镜观察，或根据黑低，只能供肉眼或放大镜观察，或根据黑度判断示踪剂的分布及相对数量。此种自度判断示踪剂的分布及相对数量。此种自显影适用于小动物的整体标本，大动物的显影适用于小动物的整体标本，大动物的整个脏器或肢体，以及层析板、免疫沉淀整个脏器或肢体，以及层析板、免疫沉淀板、骨骼、牙齿的磨片或剖面等的研究。板、骨骼、牙齿的磨片或剖面等的研究。n n（二）显微镜自显影（二）显微镜自显影（light microscopic ARG）：又称光学显微镜自显影，是借助显又称光学显微镜自显影，是借助显微镜进行组织或细胞学观察，分辨能力要求较微镜进行组织或细胞学观察，分辨能力要求较高。根据银颗粒来判断示踪剂的分布部位和数高。根据银颗粒来判断示踪剂的分布部位和数量的多少。适用于组织切片、细胞涂片等标本量的多少。适用于组织切片、细胞涂片等标本的研究。可以对不同细胞进行比较，并根据不的研究。可以对不同细胞进行比较，并根据不同示踪剂在不同时间的分布，研究细胞水平的同示踪剂在不同时间的分布，研究细胞水平的代谢过程。制备一般采用液体乳胶法。代谢过程。制备一般采用液体乳胶法。n n（三）电子显微镜自显影（三）电子显微镜自显影（electron microscopic ARG)：用于示踪剂在亚细胞结构用于示踪剂在亚细胞结构中分布情况的研究，能显示出普通显微镜观中分布情况的研究，能显示出普通显微镜观察不到的细微结构与放射性核素分布的关系。察不到的细微结构与放射性核素分布的关系。适用于细胞超微结构，甚至大分子（适用于细胞超微结构，甚至大分子（DNA 、RNA）上的精确定位和定量，也可观察动态上的精确定位和定量，也可观察动态过程。此类技术要求标本在过程。此类技术要求标本在100nm以下的超以下的超薄切片，乳胶厚度仅相当银颗粒的直径（约薄切片，乳胶厚度仅相当银颗粒的直径（约140nm）。）。三、常用的感光材料三、常用的感光材料n n放射自显影常用的感光材料包括各种类型放射自显影常用的感光材料包括各种类型的原子核乳胶、的原子核乳胶、X X线胶片、电影正片、氚片线胶片、电影正片、氚片或幻灯片。或幻灯片。（一）原子核乳胶（一）原子核乳胶n n简称核乳胶，由溴化银和明胶组成。常温简称核乳胶，由溴化银和明胶组成。常温上呈半固体，低温为明胶状，温度升至上呈半固体，低温为明胶状，温度升至40左右为液态。使用时乳胶涂层厚度可左右为液态。使用时乳胶涂层厚度可由乳胶量和稀释度（用去离子水稀释）进由乳胶量和稀释度（用去离子水稀释）进行调节。行调节。n n液体乳胶直接涂在标本或支持物上，多用于液体乳胶直接涂在标本或支持物上，多用于光镜和电镜自显影。将液体核乳胶涂在玻片光镜和电镜自显影。将液体核乳胶涂在玻片上，可抽成上，可抽成核乳胶干板核乳胶干板（nuclear emulsion plate），），再于标本接触形成自显影像，多用再于标本接触形成自显影像，多用于光镜自显影或宏观自显影。也可将干板将于光镜自显影或宏观自显影。也可将干板将乳胶层从玻片上揭下来，称为乳胶层从玻片上揭下来，称为揭膜核乳胶揭膜核乳胶（stripping film emuslon），），多用于定量的多用于定量的光镜自显影。光镜自显影。n n由溴化银、碘化银和明胶组成，银晶体颗由溴化银、碘化银和明胶组成，银晶体颗粒平均直径粒平均直径1m，对低能对低能射线敏感度高，射线敏感度高，对暗室的安全光也有相当耐受。乳胶涂在对暗室的安全光也有相当耐受。乳胶涂在醋酸纤维素酯片基的单面，乳胶面没有保醋酸纤维素酯片基的单面，乳胶面没有保护层。使用时要注意保护乳胶层面，该面护层。使用时要注意保护乳胶层面，该面直接与标本接触，以获得最佳灵敏度。主直接与标本接触，以获得最佳灵敏度。主要用于要用于3H标记化合物的宏观自显影或低倍标记化合物的宏观自显影或低倍光镜自显影。光镜自显影。（二）氚片（二）氚片（tritum film）（三）（三）X线片线片（X-ray film）n n由溴化银、碘化银和明胶组成，银晶体颗粒由溴化银、碘化银和明胶组成，银晶体颗粒直径直径2.52.5m m，对射线分辨率较低，对暗室内对射线分辨率较低，对暗室内的安全光有一定的耐受。乳胶涂在醋酸纤维的安全光有一定的耐受。乳胶涂在醋酸纤维素酯两面，外覆保护层。主要用于核素射线素酯两面，外覆保护层。主要用于核素射线能量较高的宏观自显影或低倍光镜自显影。能量较高的宏观自显影或低倍光镜自显影。四、常用的放射性核素四、常用的放射性核素n n选择放射性核素应考虑其选择放射性核素应考虑其选择放射性核素应考虑其选择放射性核素应考虑其射线种类射线种类射线种类射线种类、能量能量能量能量和和和和半衰期半衰期半衰期半衰期。核素核素核素核素 半衰期半衰期半衰期半衰期 射线类型射线类型射线类型射线类型 射线平均能量（射线平均能量（射线平均能量（射线平均能量（MeVMeV）3 3H 12.3312.33年年 0.005 0.0051414C 5730C 5730年年 0.05 0.053232P 14.28P 14.28天天 0.695 0.6953535S 87.4S 87.4天天 0.055 0.0554545Ca 165Ca 165天天 0.10 0.105959Fe 44.6Fe 44.6天天 0.12 0.12125125I 60.2I 60.2天天 、 0.0037 0.0037五、照相处理五、照相处理（一）显影和定影（一）显影和定影（二）显影液和定影液（二）显影液和定影液（三）干燥、染色和封固（三）干燥、染色和封固（一）显影和定影（一）显影和定影n n感光材料与标本接触后，经射线的作用溴感光材料与标本接触后，经射线的作用溴化银晶体形成潜影，未受核射线作用的溴化银晶体形成潜影，未受核射线作用的溴化银则不形成潜影。这两种晶体经显影和化银则不形成潜影。这两种晶体经显影和定影，才能将其区分。定影，才能将其区分。显影的作用是使银显影的作用是使银盐还原盐还原，有潜影的结晶比无潜影者显影快，有潜影的结晶比无潜影者显影快，因此适当控制显影时间可只使受照射的结因此适当控制显影时间可只使受照射的结晶呈现黑色颗粒，晶呈现黑色颗粒，定影的作用是洗去未感定影的作用是洗去未感光的银盐光的银盐。（二）显影液和定影液（二）显影液和定影液n n显影和定影是由显影液和定影液来完成的。显影和定影是由显影液和定影液来完成的。常用的显影液为常用的显影液为D-19b，定影液为定影液为F-5。显显影液和定影液的温度应严格控制在影液和定影液的温度应严格控制在191，显影时间，显影时间2-4min。显影结束后用水充分显影结束后用水充分漂洗，然后进行定影。定影时间漂洗，然后进行定影。定影时间4-8min，经水充分冲洗后晾干。显影和定影的具体经水充分冲洗后晾干。显影和定影的具体时间可通过实践选定。时间可通过实践选定。n nD-19bD-19bD-19bD-19b显影液和显影液和显影液和显影液和F-5F-5F-5F-5定影液配方定影液配方定影液配方定影液配方 D-19bD-19b显影液配方显影液配方显影液配方显影液配方 F-5F-5定影液配方定影液配方定影液配方定影液配方 水（水（水（水（55）(ml) 700 (ml) 700 水（水（水（水（55）(ml) 800(ml) 800 米吐尔（米吐尔（米吐尔（米吐尔（g g） 2 2 硫代硫酸钠硫代硫酸钠硫代硫酸钠硫代硫酸钠(g) 240 (g) 240 无水亚硫酸钠无水亚硫酸钠无水亚硫酸钠无水亚硫酸钠(g) 72 (g) 72 无水亚硫酸钠无水亚硫酸钠无水亚硫酸钠无水亚硫酸钠(g) 15(g) 15 对苯二酚（对苯二酚（对苯二酚（对苯二酚（g g） 8.8 28%8.8 28%醋酸醋酸醋酸醋酸(ml) 48(ml) 48 无水碳酸钠无水碳酸钠无水碳酸钠无水碳酸钠(g) 48 (g) 48 硼酸硼酸硼酸硼酸( (结晶结晶结晶结晶)(g) 7.5)(g) 7.5 溴化钾溴化钾溴化钾溴化钾(g) 4 (g) 4 钾矾钾矾钾矾钾矾(g) 15(g) 15 加水至加水至加水至加水至(ml) 1000 (ml) 1000 加水至加水至加水至加水至(ml) (ml) 10001000（三）干燥、染色和封固三）干燥、染色和封固n n经显影、定影和冲洗等处理的乳胶可空气经显影、定影和冲洗等处理的乳胶可空气或人工干燥，但干燥过程应避免尘粒沾污或人工干燥，但干燥过程应避免尘粒沾污乳胶，也可用酒精进行脱水干燥。干燥后乳胶，也可用酒精进行脱水干燥。干燥后可按常规方法染色（如苏木精可按常规方法染色（如苏木精- -伊红），染伊红），染色后可用盖坡片封固。色后可用盖坡片封固。六、放射自显影的分辨力六、放射自显影的分辨力n n放射自显影的目的在于研究放射性核素或其放射自显影的目的在于研究放射性核素或其标记化合物在组织内的位置，所以放射自显标记化合物在组织内的位置，所以放射自显影的分辩力，主要是指影的分辩力，主要是指位置位置的分辩力。故的分辩力。故分分辨力就是指两个相邻的放射性核素分子在标辨力就是指两个相邻的放射性核素分子在标本中的距离近以多少能在显影银颗粒上显示本中的距离近以多少能在显影银颗粒上显示为两个颗粒。为两个颗粒。银颗粒银颗粒显影显影放射源放射源可分辨可分辨不可分辨不可分辨n n半距离半距离（half distance，HD） 衡量分辨力常用半距离来表示。衡量分辨力常用半距离来表示。即一线性放射源，其显影的银即一线性放射源，其显影的银颗粒分散在放射源的两侧，银颗粒分散在放射源的两侧，银颗粒随着与放射源的距离的增颗粒随着与放射源的距离的增加而减少，当银颗粒减少到一加而减少，当银颗粒减少到一半时，此距离称半时，此距离称半距离半距离。若放。若放射源为点状源则以射源为点状源则以半半径半半径来表来表示。示。HDn n影响分辨力的主要因素：影响分辨力的主要因素：n n1、核素的能量核素的能量：核素的能量越高，射线的：核素的能量越高，射线的射程较长。分散的银颗粒就较多，因而分辨射程较长。分散的银颗粒就较多，因而分辨力下降。如在相同条件下，力下降。如在相同条件下，3H、14C、32P的的自显影分辨力依次下降。自显影分辨力依次下降。射线能量低的自显影射线能量低的自显影射线能量高的自显影射线能量高的自显影n n影响分辨力的主要因素：影响分辨力的主要因素：n n2、样品的厚度、样品的厚度：样品厚，组织表面和深层样品厚，组织表面和深层中放射源的射线同时射入乳胶层，使银颗粒中放射源的射线同时射入乳胶层，使银颗粒分散程度加重，影像重叠，分辨力下降。样分散程度加重，影像重叠，分辨力下降。样品薄，则分辨力高，但曝光时间需加长。品薄，则分辨力高，但曝光时间需加长。薄样品自显影薄样品自显影厚样品自显影厚样品自显影n n影响分辨力的主要因素：影响分辨力的主要因素：n n3、乳胶层的厚度、乳胶层的厚度：较薄的乳胶层记录的是较薄的乳胶层记录的是离放射源最近的径迹起始部，随乳胶加厚，离放射源最近的径迹起始部，随乳胶加厚，记录的包括径迹起始部和远离放射源的部分，记录的包括径迹起始部和远离放射源的部分，偏离放射源的机会越多，分辨力下降。偏离放射源的机会越多，分辨力下降。乳胶层厚，形成较大的影像乳胶层厚，形成较大的影像n n影响分辨力的主要因素：影响分辨力的主要因素：n n4、样品与乳胶层的间隙、样品与乳胶层的间隙：距离大者，射线距离大者，射线散射面积也大，影像越不清晰，分辨力下降。散射面积也大，影像越不清晰，分辨力下降。样品与乳胶层间隙大，形成较大显影样品与乳胶层间隙大，形成较大显影n n影响分辨力的主要因素：影响分辨力的主要因素：n n5、乳胶银晶体大小、乳胶银晶体大小：显影银颗粒不一定于显影银颗粒不一定于原有的卤化银位置完全一致，故银晶体越小，原有的卤化银位置完全一致，故银晶体越小，则显影银颗粒越小，分辨力就越好。则显影银颗粒越小，分辨力就越好。n n6、曝光时间、曝光时间：正常曝光时间，核素中占多正常曝光时间，核素中占多数的中、低能量射线作用于乳胶，分辨力高。数的中、低能量射线作用于乳胶，分辨力高。时间过长，则高能射线作用乳胶几率增加，时间过长，则高能射线作用乳胶几率增加，散射加大，分辨力下降。散射加大，分辨力下降。n n7、显影时间、显影时间：显影时间长，可使一些未感显影时间长，可使一些未感光的银粒被还原，使影像界限不清，分辨力光的银粒被还原，使影像界限不清，分辨力下降。下降。七、放射自显影的本底、效率七、放射自显影的本底、效率n n1 1、本底、本底：在自显影上，除标本内的放射性核在自显影上，除标本内的放射性核素外，由其他原因造成的显影颗粒，统称素外，由其他原因造成的显影颗粒，统称自自显影的本底显影的本底。本底过高不仅对低水平放射性。本底过高不仅对低水平放射性的测量，而且降低分辨力。的测量，而且降低分辨力。n n暗室红灯过量或感光材料在红灯下曝露时间暗室红灯过量或感光材料在红灯下曝露时间过长、显影液温度过高或时间过长、感光材过长、显影液温度过高或时间过长、感光材料过期或保存温度过高、感光材料的机械弯料过期或保存温度过高、感光材料的机械弯折或涂液体乳胶干燥过快以及感光材料沾污折或涂液体乳胶干燥过快以及感光材料沾污还原性物质等，是引起自显影本底过高的常还原性物质等，是引起自显影本底过高的常见原因。见原因。n n自显影的效率自显影的效率：系指待测标本中的放射性系指待测标本中的放射性核素在曝光时间内，每核素在曝光时间内，每100次衰变所给出的显次衰变所给出的显影银粒数目。影银粒数目。n n粗略估计，当粗略估计，当3H标本的厚度为标本的厚度为1m、密度为密度为1.1时，光镜自显影中的效率为时，光镜自显影中的效率为10%15%，而厚度为而厚度为5 m者，效率则为者，效率则为4% 5%（很多（很多深层深层粒子不能从标本中射出）。粒子不能从标本中射出）。32P标本在标本在同样条件下的效率为同样条件下的效率为30% 40%，在电镜自，在电镜自显影中，显影中，3H的效率为的效率为25%。第二节第二节 放射自显影的基本方法放射自显影的基本方法及结果分析及结果分析n n医学生物学示踪研究中的自显影实验，一般环医学生物学示踪研究中的自显影实验，一般环节是：节是：1 1、示踪示踪：向实验动物或离体标本引入：向实验动物或离体标本引入放射性核素标记物。放射性核素标记物。2 2、标本制备、标本制备：取生物标：取生物标本并制备成含放射性核素的切片、涂片或电泳、本并制备成含放射性核素的切片、涂片或电泳、层析分离的标本。层析分离的标本。3 3、自显影制备、自显影制备：暗室中在：暗室中在标本上敷加感光材料。标本上敷加感光材料。4 4、曝光、曝光：避光条件下：避光条件下核射线作用于感光材料。核射线作用于感光材料。5 5、照相处理、照相处理：显影、：显影、定影、水洗、干燥、染色、封固。最后是定影、水洗、干燥、染色、封固。最后是阅读阅读分析分析。一、示踪剂引入的方法一、示踪剂引入的方法n n（一）引入途径（一）引入途径n n（二）引入方法（二）引入方法n n（一）引入途径（一）引入途径n n1 1、体内实验体内实验：可由静脉、皮下、肌肉、腹可由静脉、皮下、肌肉、腹腔或直接脑内注射和灌胃等途径引入放射性腔或直接脑内注射和灌胃等途径引入放射性标记化合物。标记化合物。n n2 2、体外实验、体外实验：对组织、细胞、体液的培养：对组织、细胞、体液的培养过程，则可在培养瓶中引入。在离体标本上过程，则可在培养瓶中引入。在离体标本上研究受体等生物活性物质，也常将示踪剂直研究受体等生物活性物质，也常将示踪剂直接加在切片上进行结合反应，然后洗去多余接加在切片上进行结合反应，然后洗去多余的示踪剂后再进行自显影。的示踪剂后再进行自显影。二、放射自显影的标本制备二、放射自显影的标本制备总要求：总要求：标本制备过程不能引起示踪剂的流标本制备过程不能引起示踪剂的流失或移动失或移动。（一）组织切片（一）组织切片（二）整体小动物或大动物脏器切片（二）整体小动物或大动物脏器切片（三）牙齿、骨骼（三）牙齿、骨骼（四）体液、培养液中的细胞或其他成分（四）体液、培养液中的细胞或其他成分（五）电镜标本（五）电镜标本（六）无细胞的标本（六）无细胞的标本n n（一）组织切片（一）组织切片n n1 1 1 1、冰冻切片冰冻切片：标本采集后不经固定，直接快速：标本采集后不经固定，直接快速：标本采集后不经固定，直接快速：标本采集后不经固定，直接快速冷冻。冰冻的标本不能反复冻融，直接放置冷冻。冰冻的标本不能反复冻融，直接放置冷冻。冰冻的标本不能反复冻融，直接放置冷冻。冰冻的标本不能反复冻融，直接放置-80-80-80-80备备备备用。然后进行切片，切片冷冻干燥后，移入室温后用。然后进行切片，切片冷冻干燥后，移入室温后用。然后进行切片，切片冷冻干燥后，移入室温后用。然后进行切片，切片冷冻干燥后，移入室温后置置置置4444进行自显影。适用于扩散性示踪实验和需保存进行自显影。适用于扩散性示踪实验和需保存进行自显影。适用于扩散性示踪实验和需保存进行自显影。适用于扩散性示踪实验和需保存生物活性的实验。生物活性的实验。生物活性的实验。生物活性的实验。n n2 2、石蜡切片、石蜡切片：标本经固定液固定（福尔马林、：标本经固定液固定（福尔马林、：标本经固定液固定（福尔马林、：标本经固定液固定（福尔马林、多聚甲醛）固定、水洗、脱水、二甲苯浸透、石蜡多聚甲醛）固定、水洗、脱水、二甲苯浸透、石蜡多聚甲醛）固定、水洗、脱水、二甲苯浸透、石蜡多聚甲醛）固定、水洗、脱水、二甲苯浸透、石蜡包埋等过程，常温下切片。标本不宜用含重金属盐包埋等过程，常温下切片。标本不宜用含重金属盐包埋等过程，常温下切片。标本不宜用含重金属盐包埋等过程，常温下切片。标本不宜用含重金属盐的固定液，防止干扰结果。固定后必须充分水洗，的固定液，防止干扰结果。固定后必须充分水洗，的固定液，防止干扰结果。固定后必须充分水洗，的固定液，防止干扰结果。固定后必须充分水洗，制备过程中示踪剂和某些组织成分可能发生扩散或制备过程中示踪剂和某些组织成分可能发生扩散或制备过程中示踪剂和某些组织成分可能发生扩散或制备过程中示踪剂和某些组织成分可能发生扩散或流失，一般只用于非扩散性实验。流失，一般只用于非扩散性实验。流失，一般只用于非扩散性实验。流失，一般只用于非扩散性实验。n n（二）整体小动物或大动物脏器切片（二）整体小动物或大动物脏器切片n n实验动物引入示踪剂后，用药物麻醉动物，实验动物引入示踪剂后，用药物麻醉动物，然后将动物投入干冰丙酮混合液或液氮中然后将动物投入干冰丙酮混合液或液氮中快速冷冻，以防组织内形成结晶，待全部快速冷冻，以防组织内形成结晶，待全部冻结，用羟甲基纤维素包埋动物，包埋块冻结，用羟甲基纤维素包埋动物，包埋块在整体切片机上制成切片，再进行自显影在整体切片机上制成切片，再进行自显影操作。操作。n n（三）牙齿、骨骼（三）牙齿、骨骼n n观察无机成分时，可在磨石上制成磨片。观察无机成分时，可在磨石上制成磨片。先用先用10%10%福尔马林固定，经磨石加水研磨至福尔马林固定，经磨石加水研磨至表面平整的薄片或剖面，然后乙醇脱水、表面平整的薄片或剖面，然后乙醇脱水、干燥，再进行自显影。观察有机成分时，干燥，再进行自显影。观察有机成分时，可脱钙后制成石蜡切片。可脱钙后制成石蜡切片。n n（四）体液、培养液中的细胞或其他成分（四）体液、培养液中的细胞或其他成分n n可直接离心浓缩后制成细胞涂片，培养的细胞可直接离心浓缩后制成细胞涂片，培养的细胞也可制备细胞爬片，细胞应制成单层。离体实也可制备细胞爬片，细胞应制成单层。离体实验中，细胞周围常有大量游离示踪剂，应充分验中，细胞周围常有大量游离示踪剂，应充分洗涤后再制备涂片。固定涂片的固定液应根据洗涤后再制备涂片。固定涂片的固定液应根据研究对象进行选择，如研究核酸时用甲醇：冰研究对象进行选择，如研究核酸时用甲醇：冰醋酸（醋酸（3：1），蛋白质则选用），蛋白质则选用10%福尔马林做福尔马林做固定液，干燥后进行自显影。固定液，干燥后进行自显影。n n（五）电镜标本（五）电镜标本n n电镜标本的制备与一般标本制备不同，标电镜标本的制备与一般标本制备不同，标本先用本先用2%戊二醛固定，缓冲液洗涤，再用戊二醛固定，缓冲液洗涤，再用锇酸固定，冲洗，系列丙酮或乙醇脱水，锇酸固定，冲洗，系列丙酮或乙醇脱水，环氧树脂包埋。然后用超薄切片抽切片，环氧树脂包埋。然后用超薄切片抽切片，切片厚度为切片厚度为50100m。再涂核乳胶，进行再涂核乳胶，进行自显影。自显影。n n（六）无细胞标本（六）无细胞标本n n示踪研究所用的各种电泳谱、色层条、免示踪研究所用的各种电泳谱、色层条、免疫沉淀板，可按常规方法进行处理、干燥，疫沉淀板，可按常规方法进行处理、干燥，然后再用接触法做自显影。然后再用接触法做自显影。三、自显影制备三、自显影制备（一）接触法（一）接触法（二）液体核乳胶浸膜法（二）液体核乳胶浸膜法（三）揭膜乳胶法（三）揭膜乳胶法（四）融裱法（四）融裱法（五）金属环法（五）金属环法n n（一）接触法（一）接触法n n在暗室中，将标本面与感光胶片或核乳胶在暗室中，将标本面与感光胶片或核乳胶干板的乳胶面密切接触，进行曝光而制备干板的乳胶面密切接触，进行曝光而制备自显影的方法称为自显影的方法称为接触法接触法。标本与感光材。标本与感光材料均不接触水或有机溶剂，不会造成示踪料均不接触水或有机溶剂，不会造成示踪剂的扩散或流失，适用于各种实验。剂的扩散或流失，适用于各种实验。n n（二）液体核乳胶浸膜法（二）液体核乳胶浸膜法n n在暗室中，将标本或载有标本的玻片浸入适在暗室中，将标本或载有标本的玻片浸入适当稀释的液体核乳胶中，使标本表面敷上一当稀释的液体核乳胶中，使标本表面敷上一层薄而均匀的乳胶膜，干燥后曝光而制备处层薄而均匀的乳胶膜，干燥后曝光而制备处显影的方法称液体核乳胶浸膜法。在浸膜过显影的方法称液体核乳胶浸膜法。在浸膜过程中，标本要与含水的液体核乳胶接触，会程中，标本要与含水的液体核乳胶接触，会造成扩散性示踪剂一定程度的扩散和流失，造成扩散性示踪剂一定程度的扩散和流失，故只适用于非扩散性示踪实验。故只适用于非扩散性示踪实验。n n（三）揭膜乳胶法（三）揭膜乳胶法n n将揭膜乳胶膜从玻璃基片上揭下来，在温将揭膜乳胶膜从玻璃基片上揭下来，在温水中展开，浸透，然后将其贴于标本表面，水中展开，浸透，然后将其贴于标本表面，干燥后曝光而制备自显影。揭膜乳胶厚度干燥后曝光而制备自显影。揭膜乳胶厚度均匀，该法常用于光镜自显影的定量研究。均匀，该法常用于光镜自显影的定量研究。因需在水中进行，故适用于非扩散性示踪因需在水中进行，故适用于非扩散性示踪实验。实验。n n（四）融裱法（四）融裱法n n用预冷的核乳胶干板沾取刚刚切下的冰冻用预冷的核乳胶干板沾取刚刚切下的冰冻组织切片，并使其贴牢在乳胶面上，冻干组织切片，并使其贴牢在乳胶面上，冻干后进行曝光制备自显影。主要用于光镜自后进行曝光制备自显影。主要用于光镜自显影的扩散性示踪实验。显影的扩散性示踪实验。n n（五）金属环法（五）金属环法n n电镜自显影常用的方法。即将核乳胶在暗室电镜自显影常用的方法。即将核乳胶在暗室中按中按1：4与蒸馏水稀释，与蒸馏水稀释，40融化并缓慢搅融化并缓慢搅拌拌1h，存放存放4过夜使其稳定。然后再融化并过夜使其稳定。然后再融化并搅拌搅拌1h，将其冷却到将其冷却到25。用不锈钢制成的。用不锈钢制成的金属环（金属环（1030mm）插入核乳胶中，垂直插入核乳胶中，垂直提出，在金属环上便形成一层单层乳胶膜。提出，在金属环上便形成一层单层乳胶膜。将其敷在电镜切片所放置的铜网上，将其敷在电镜切片所放置的铜网上，4曝光曝光制备自显影。制备自显影。四、自显影的阅读分析四、自显影的阅读分析（一）宏观自显影的阅读分析（一）宏观自显影的阅读分析（二）光镜自显影的阅读分析（二）光镜自显影的阅读分析（三）电镜自显影的阅读分析（三）电镜自显影的阅读分析n n（一）宏观自显影的阅读（一）宏观自显影的阅读分析分析n n宏观自显影的影像可直接用宏观自显影的影像可直接用宏观自显影的影像可直接用宏观自显影的影像可直接用肉眼观察。比本底黑的部份肉眼观察。比本底黑的部份肉眼观察。比本底黑的部份肉眼观察。比本底黑的部份即表示放射性示踪剂的存在，即表示放射性示踪剂的存在，即表示放射性示踪剂的存在，即表示放射性示踪剂的存在，黑度越大，表示该处放射性黑度越大，表示该处放射性黑度越大，表示该处放射性黑度越大，表示该处放射性越强，示踪剂分布越多。观越强，示踪剂分布越多。观越强，示踪剂分布越多。观越强，示踪剂分布越多。观察时，需将自显影像与标本察时，需将自显影像与标本察时，需将自显影像与标本察时，需将自显影像与标本重合起来观察，以准确定位。重合起来观察，以准确定位。重合起来观察，以准确定位。重合起来观察，以准确定位。如将自显影像用光密度计进如将自显影像用光密度计进如将自显影像用光密度计进如将自显影像用光密度计进行测量，则可进行定量分析。行测量，则可进行定量分析。行测量，则可进行定量分析。行测量，则可进行定量分析。n n（二）光镜自显影的阅读分析（二）光镜自显影的阅读分析n n通过在光镜下观察自显影像上银颗粒分布的通过在光镜下观察自显影像上银颗粒分布的位置和密度而确定放射性示踪剂存在部位和位置和密度而确定放射性示踪剂存在部位和数量。自显影像上单位面积的显影银颗粒数数量。自显影像上单位面积的显影银颗粒数目，与该处示踪剂的放射性活度呈正比。目，与该处示踪剂的放射性活度呈正比。n n光镜自显影的定量分析光镜自显影的定量分析n n二种方法：一是计数被示踪剂标记的细胞或二种方法：一是计数被示踪剂标记的细胞或细胞核在细胞群体中所占的百分率，即标记细胞核在细胞群体中所占的百分率，即标记指数。通常一个细胞核上有指数。通常一个细胞核上有4 4个以上银颗粒作个以上银颗粒作为标记细胞。另一种是计数自显影像上某部为标记细胞。另一种是计数自显影像上某部位单位面积（用显微镜测微尺测量面积）上位单位面积（用显微镜测微尺测量面积）上银颗粒数目，或计数某种组织细胞上的银颗银颗粒数目，或计数某种组织细胞上的银颗粒数目。粒数目。n n（三）电镜自显（三）电镜自显影的阅读分析影的阅读分析n n一般在电镜照片上一般在电镜照片上进行，可以通过银进行，可以通过银颗粒的位置、数目颗粒的位置、数目来确定放射性示踪来确定放射性示踪剂在亚细胞结构的剂在亚细胞结构的分布，以及数量。分布，以及数量。第三节第三节 自显影的应用自显影的应用n n放射自显影具有示踪、定位、定量和定时放射自显影具有示踪、定位、定量和定时等优点，能准确而精细地将机体的生理功等优点，能准确而精细地将机体的生理功能、生化代谢、增殖等变化与细胞、组织能、生化代谢、增殖等变化与细胞、组织和器官紧密结合起来。在生物医学领域应和器官紧密结合起来。在生物医学领域应用范围十分广泛。用范围十分广泛。一、物质在体内的分布、代谢一、物质在体内的分布、代谢n n用放射性自显影可动态观察生理或病理状用放射性自显影可动态观察生理或病理状态下放射性核素标记的各种药物、毒物、态下放射性核素标记的各种药物、毒物、营养物质等在脏器、组织、细胞中的分布、营养物质等在脏器、组织、细胞中的分布、转运、蓄积和排泄，以研究其代谢规律、转运、蓄积和排泄，以研究其代谢规律、作用部位及作用机理等。作用部位及作用机理等。二、生物活性物质的合成、代谢研究二、生物活性物质的合成、代谢研究n n以适宜的放射性核素标记某些生命物质的前体，以适宜的放射性核素标记某些生命物质的前体，如如DNA的特异性前体胸腺嘧啶核苷、的特异性前体胸腺嘧啶核苷、RNA的的特异性前体尿嘧啶核苷、蛋白质的特异性前体特异性前体尿嘧啶核苷、蛋白质的特异性前体氨基酸、类固醇激素的前体胆固醇等，用自显氨基酸、类固醇激素的前体胆固醇等，用自显影追踪这些标记前体在组织、细胞中的部位、影追踪这些标记前体在组织、细胞中的部位、参入数量、参入时间、影响因素以及合成产物参入数量、参入时间、影响因素以及合成产物的转运情况等，可能研究各种生物活性物质在的转运情况等，可能研究各种生物活性物质在体内或细胞中合成、代谢的部位、动态及其机体内或细胞中合成、代谢的部位、动态及其机理，还可由此了解细胞功能，应用十分广泛。理，还可由此了解细胞功能，应用十分广泛。三、特异性抗原、受体、三、特异性抗原、受体、DNADNA片段等的分布片段等的分布n n用标记抗体、标记受体的配基或互补用标记抗体、标记受体的配基或互补RNA（DNA）等，将这些特定的标记物引等，将这些特定的标记物引入体内或与离体组织细胞标本反应，根据入体内或与离体组织细胞标本反应，根据这些特定的标记物在体内或标本分布的情这些特定的标记物在体内或标本分布的情况，以揭示与它们有特异亲合力的抗原、况，以揭示与它们有特异亲合力的抗原、受体、受体、DNA片段在组织、细胞中的分布，片段在组织、细胞中的分布，以进行深入的机理研究。以进行深入的机理研究。四、其他方面应用四、其他方面应用n n放射自显影还在分子生物学研究中的限制放射自显影还在分子生物学研究中的限制性内切酶图谱分析、性内切酶图谱分析、DNADNA和和RNARNA的序列分析、的序列分析、DNADNA指纹图谱分析，生物化学中的各种电泳指纹图谱分析，生物化学中的各种电泳图谱、层析图谱以及免疫学研究中的各种图谱、层析图谱以及免疫学研究中的各种免疫沉淀反应中被用不显示不同处理或反免疫沉淀反应中被用不显示不同处理或反应后标记物的位置和数量。应后标记物的位置和数量。思考题思考题一、定义：放射自显影、自显影的分辨力一、定义：放射自显影、自显影的分辨力二、二、1 1、放射自显影的原理、放射自显影的原理 2 2、放射自显影的基本方法、放射自显影的基本方法 3 3、放射自显影在生物医学中的应用、放射自显影在生物医学中的应用 三、三、三、三、1 1、自显影曝光时应在、自显影曝光时应在、自显影曝光时应在、自显影曝光时应在干燥干燥干燥干燥、低温低温低温低温、少氧少氧少氧少氧的环境的环境的环境的环境中进行。中进行。中进行。中进行。 2 2、衡量自显影的分辨力常用、衡量自显影的分辨力常用、衡量自显影的分辨力常用、衡量自显影的分辨力常用半距离半距离半距离半距离表示表示表示表示 3 3、自显影的类型有、自显影的类型有、自显影的类型有、自显影的类型有宏观宏观宏观宏观ARGARG、显微镜显微镜显微镜显微镜ARGARG和和和和电电电电镜镜镜镜ARGARG 4 4、显影的作用是显影的作用是显影的作用是显影的作用是使银盐还原为银颗粒使银盐还原为银颗粒使银盐还原为银颗粒使银盐还原为银颗粒，常用的，常用的，常用的，常用的显影液是显影液是显影液是显影液是D-19bD-19b，定影的作用是定影的作用是定影的作用是定影的作用是洗去未感光的银盐洗去未感光的银盐洗去未感光的银盐洗去未感光的银盐，常用的定影液是常用的定影液是常用的定影液是常用的定影液是F-5F-5 5 5、影响自显影分辨力的因素有影响自显影分辨力的因素有影响自显影分辨力的因素有影响自显影分辨力的因素有核素能量核素能量核素能量核素能量、样品样品样品样品厚度厚度厚度厚度、乳胶层厚度乳胶层厚度乳胶层厚度乳胶层厚度、样品与乳胶层的间隙样品与乳胶层的间隙样品与乳胶层的间隙样品与乳胶层的间隙、银晶体银晶体银晶体银晶体的大小的大小的大小的大小、曝光时间曝光时间曝光时间曝光时间和和和和显影时间显影时间显影时间显影时间。ARGARG在细胞周期研究中在细胞周期研究中的应用的应用n n细胞增殖是一个复杂的问题，近年来随着细胞增殖是一个复杂的问题，近年来随着新技术的发展与应用，在细胞形态学研究新技术的发展与应用，在细胞形态学研究的基础上，对细胞增殖研究已形成一门新的基础上，对细胞增殖研究已形成一门新的学科的学科细胞动力学（细胞动力学（cell kinetics）。）。它是研究生物体内各种细胞群体在新生、它是研究生物体内各种细胞群体在新生、增殖和消亡过程中处于各种状态时的时间增殖和消亡过程中处于各种状态时的时间参数、细胞数量、分布位置、细胞迁移等。参数、细胞数量、分布位置、细胞迁移等。细胞动力学是生物学中一门研究范围广泛、细胞动力学是生物学中一门研究范围广泛、实用性极强的分支学科。实用性极强的分支学科。一、细胞周期一、细胞周期n n细胞周期（细胞周期（细胞周期（细胞周期（cell cyclecell cycle）是指从一次分裂结束到下是指从一次分裂结束到下是指从一次分裂结束到下是指从一次分裂结束到下次分裂终止所经历的历程，它包括细胞生长和分次分裂终止所经历的历程，它包括细胞生长和分次分裂终止所经历的历程，它包括细胞生长和分次分裂终止所经历的历程，它包括细胞生长和分裂周期。通常将细胞周期分为四个时相裂周期。通常将细胞周期分为四个时相裂周期。通常将细胞周期分为四个时相裂周期。通常将细胞周期分为四个时相（phasephase），即），即），即），即DNADNA合成期（合成期（合成期（合成期（S S期）、有丝分裂期）、有丝分裂期）、有丝分裂期）、有丝分裂期（期（期（期（MM期）、复制前期（期）、复制前期（期）、复制前期（期）、复制前期（G1G1期）、复制后期（期）、复制后期（期）、复制后期（期）、复制后期（G2G2期）。期）。期）。期）。n n一个细胞完成有丝分裂后，并非所有细胞都可进一个细胞完成有丝分裂后，并非所有细胞都可进一个细胞完成有丝分裂后，并非所有细胞都可进一个细胞完成有丝分裂后，并非所有细胞都可进入入入入G1G1期，其中部分细胞不进入下一个细胞周期而期，其中部分细胞不进入下一个细胞周期而期，其中部分细胞不进入下一个细胞周期而期，其中部分细胞不进入下一个细胞周期而处于处于处于处于“ “静止静止静止静止” ”状态，这种细胞被称为静止细胞或状态，这种细胞被称为静止细胞或状态，这种细胞被称为静止细胞或状态，这种细胞被称为静止细胞或休止细胞以及休止细胞以及休止细胞以及休止细胞以及G0G0期细胞期细胞期细胞期细胞。无增殖能无增殖能力细胞或力细胞或凋亡细胞凋亡细胞死亡死亡G0期期G1期期2nDNAS期期2-4n DNAG2期期4nDNAM期期n n很久以来，人们就注意到了细胞细胞分裂很久以来，人们就注意到了细胞细胞分裂现象并进行了大量研究。现象并进行了大量研究。20世纪世纪50年代初，年代初，Howard对对32P-磷酸盐培养的磷酸盐培养的RNA酶处理过酶处理过的蚕豆尖细胞进行了研究，借助放射自显的蚕豆尖细胞进行了研究，借助放射自显影技术，首次证明了被标记的细胞不是分影技术，首次证明了被标记的细胞不是分裂细胞，而是间期细胞，表明裂细胞，而是间期细胞，表明DNA合成是合成是在新时期完成的，并发现在开始标记在新时期完成的，并发现在开始标记8h才才出现标记的分裂核，持续出现标记的分裂核，持续6h后开始减少。后开始减少。这种变化每这种变化每30h出现一次，因此提出了细胞出现一次，因此提出了细胞周期概念。周期概念。n n20世纪世纪50年代未年代未Quastler和和Sherman用用3H-TdR和放射自显影技术进一步证明和放射自显影技术进一步证明了了DNA确实在间期合成的，在细胞周确实在间期合成的，在细胞周期活动中的确存在期活动中的确存在DNA合成期（合成期（S）和和细胞分裂期（细胞分裂期（M）。在）。在S和和M期之间以期之间以及及S期之前，各有一个间隔，分别称为期之前，各有一个间隔，分别称为DNA合成后期（合成后期（G2）和）和DNA合成前期合成前期（G1），），进而将细胞周期分为进而将细胞周期分为G1、S、G2、M四个时相。四个时相。二、常有术语二、常有术语n n1、时间参数：、时间参数： TG1：G1期持续时间期持续时间 TG2：G2期持续时间期持续时间 TS： S期持续时间期持续时间 TM： M期持续时间期持续时间 TC： 一个细胞周期持续时间一个细胞周期持续时间n n2、指数：、指数： LI：标记指数（标记细胞在群体中所占比例）标记指数（标记细胞在群体中所占比例） GF：生长指数（处于增殖状态细胞在群体中生长指数（处于增殖状态细胞在群体中所占比例）所占比例） MI：有丝分裂指数（有丝分裂细胞在群体中有丝分裂指数（有丝分裂细胞在群体中所占比例）所占比例）三、原理三、原理n n细胞动力学研究，最重要的是对细胞进行细胞动力学研究，最重要的是对细胞进行标记。胸腺嘧啶核苷（标记。胸腺嘧啶核苷（TdR）是）是DNA的特的特有前身物，处于有前身物，处于S期细胞能摄取期细胞能摄取TdR合成合成DNA。将。将3H-TdR或或14C-TdR放入实验培养放入实验培养体系中，它只能被体系中，它只能被S期细胞摄取，而不改变期细胞摄取，而不改变DNA分子的生物、化学特性。根据探测到分子的生物、化学特性。根据探测到的的3H或或14C量可以了解被标记细胞的增殖、量可以了解被标记细胞的增殖、分化和消亡规律。分化和消亡规律。四、方法四、方法n n（一）一次标记一次取样法（一）一次标记一次取样法 将将3H-TdR加入细胞培养加入细胞培养1530min，洗涤后做放洗涤后做放射自显影，计算标记细胞，并按公式计算标记指射自显影，计算标记细胞，并按公式计算标记指数（数（LI） LI=Ns/Nc Ns：标记细胞数；标记细胞数；Nc：处于细胞周期中的总数处于细胞周期中的总数 在一个稳定细胞群体中，细胞处于某时相的细胞在一个稳定细胞群体中，细胞处于某时相的细胞数量与该时相的时间呈正比，故：数量与该时相的时间呈正比，故： LI=Ts/Tcn（二）一次标记多次取样法（二）一次标记多次取样法 又称有丝分裂百分率法。即一次标记后，又称有丝分裂百分率法。即一次标记后，在一定时间内多次取样，用放射自显影或在一定时间内多次取样，用放射自显影或液闪测量，观察液闪测量，观察M期（有丝分裂期）细胞中期（有丝分裂期）细胞中标记细胞的比例，即有丝分裂标记百分比标记细胞的比例，即有丝分裂标记百分比（PLM）。）。 PLM=标记标记M期细胞数期细胞数/M期细胞总数期细胞总数 以以PLM为纵坐标，时间为横坐标可得为纵坐标，时间为横坐标可得PLM曲线。曲线。TG2TM TsTcTcTsTG1 +TG2TG2五、细胞动力学在生物医学中的应用五、细胞动力学在生物医学中的应用1、肿瘤细胞的周期化、同步化、肿瘤细胞的周期化、同步化2、肿瘤疗效和预后监测、肿瘤疗效和预后监测3、用、用LI检测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性检测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性4、上皮细胞增生性变的细胞动力学监测、上皮细胞增生性变的细胞动力学监测5、在实验血液学领域中的应用、在实验血液学领域中的应用