物理图的绘制2021/6/1612021/6/1622021/6/163分子信标及FRET分析2021/6/164分子信标原理提出的原因：分子信标的设想其是一种设计巧妙的荧光标记的核酸探针。2021/6/165分子信标工作原理2021/6/166分子信标的结构环 含识别序列，一般15 -33个核苷酸茎 在两末端各接上5到8个核苷酸的互补序列，富含GC荧光素及猝灭剂2021/6/1672021/6/168分子信标的设计分子信标探针部分的长度为1533个核苷酸探针-靶杂交物的熔点，可由GC按规律预测小于20 Tm=2（A+T）4（G+C）2021/6/169选定探针序列后，在其两端各加上一段茎分子信标茎的长度一般为57bp分子信标Tm值，不可从GC含量来推算G 有时有荧光猝灭作用分子信标和PCR引物之间没有互补部分重要一点是让分子信标成为设计中的发夹结构自由能愈高结构愈稳定2021/6/1610荧光素又称荧光染料，多数是杂环或多环芳烃类化合物可吸引光能成为不稳定的激发态，存在时间为10-910-8 s吸光波长与发光波长之差，称为Stokes偏移2021/6/16112021/6/1612几个概念最大激发波长最大发射波长消光系数发射效率2021/6/1613荧光素的光漂白荧光基因在激发态时受到光的不可逆破坏解决办法抗光漂白试剂加入用低强度及宽谱带的光激发并用最高灵敏度的检测系统检测改用光稳定性较好，具有类似吸收/发射光谱的染料2021/6/16142021/6/1615猝灭剂荧光染料发射的光能，可被邻近的染料或非染料分子所吸收转成热能而不再发射荧光，也可以发射能量较低的荧光2021/6/16162021/6/1617PRET激光共振能量转移：受激发荧光素的能量转移到邻近的另一荧光素，并不发射荧光而使激发荧光素回复基态时的现象。条件荧光素间的距离要近光谱要有一定程度重叠2021/6/16182021/6/1619能量变化的可能情况内部能量转换光发射动态静态猝灭PRET2021/6/1620PRET的基本要求供体分子丧失激发能S1到S 0要与受体分子被激发所需能量相匹配发生PRET的另一要求是供体分子与受体分子间的能量转移与距离密切相关2021/6/16212021/6/16222021/6/16232021/6/1624遗传图的不足遗传图的分辩率有限遗传图的精确度较低2021/6/1625物理作图技术限制性作图依靠克隆的基因作图荧光标记原位杂交（FISH）顺序标签位点（STS）作图2021/6/1626限制性作图基因原位点工理：比较不同酶解产生片段的大小对于2个或者多个相同酶切位点区域，采用部分酶切当限制位点过多时，采用末端同位素标记的方法结合部分酶解处理2021/6/1627稀有切点限制酶内切酶的类型内切酶的切割结果内切酶的切割片段的推断4n稀有切点限制图绘制识别顺序越长，产生的片段越大识别片段的碱基组成影响片段的大小对于识别位点较长的限制酶，不区别应用基因组的甲基化状态2021/6/16282021/6/1629DNA分子限制性作图限制性作图只适应于较小的DNA分子，上限取决于作图分子中限制酶位点的频率。一般50KB以下。限制图能否用于50KB以上？2021/6/1630大分子DNA片段的分离小分子，一般分子分子杂交2021/6/1631交变电场琼脂糖凝胶电泳2021/6/1632基于克隆的基因组作图质料载体克隆载体及与质料结合的粘粒拟南芥，1.2108，需要2500个40KB克隆，如果达到99.9%的覆盖率，需要25000个，人类基因则需要上百万个。2021/6/1633大分子DNA的克隆载体YAC（yeast artificial chromosomes,酵母人工染色体）其是根据真核染色体的结构设计的着丝粒端粒起点自主复制可载容易为2301700KB之间2021/6/16342021/6/1635含有人工染色体的酵母方可在基本培养基中生长，插入片段存在时，酶失活，克隆显示红色，否则为白色2021/6/1636YAC缺陷插入部分的稳定性问题同一细胞内不同YAC的重组交换，形成嵌合顺序2021/6/1637噬菌体P1载体将天然噬菌体基因组中的一段缺失，容易相当于缺失区段的大小及颗粒所容纳的空间。可达125kb2021/6/16382021/6/1639是 Sternberg 基于 P1 噬菌体构建的，与黏粒载体工作原理比较相似的一种高通量载体。它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70100kb 大小的基因组DNA片段（Sternberg 1990, 1992, 1994） 。在这种系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中，后者总容量可达 115kb （包括载体和插入片段）。将重组 DNA 注射到表达 Cre 重组酶的大肠杆菌中，线状 DNA 分子通过重组于载体的两个 loxP 位点之间而发生环化。另外，载体还携带一个通用的选择标记 kan r ，一个区分携带外源 DNA 克隆的阳性标记 sacB 以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的 P1 质粒复制子。另一个 P1 复制子（ P1 裂解性复制子）在可诱导的 lac 启动子（IPTG 诱导）控制下，用于 DNA 分离前质粒的扩增。2021/6/1640结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。然而除了将连接产物包装进入噬菌体颗粒以及在 cre-loxP 位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组 PAC 也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状态维持 （Ioannou et al. 1994） 。代表性 PAC 载体 pCYPAC1 遗传结构图 见图 3-30 。基于 PAC 的人类基因组文库插入片段的大小在 60kb150kb 之间。 2021/6/1641细菌人工染色体BAC（bacterial artificial chromosomes)其源于大肠杆菌的F质料，容易可达300KB特点：单拷贝复制相对分子质量大稳定制备方法简单，便于机械化操作2021/6/1642BAC载体物理图2021/6/1643P1人工染色体PAC（P1derived artificial chromosomes)结合了P1载体与BAC载体的优点，可载片段达300KB2021/6/1644P1人工染色体2021/6/16452021/6/1646F粘粒具有F质料的复制起点及的COS位点，功能与粘粒类似，拷贝数低。2021/6/1647重叠群的组建相互重叠的DNA片段组成的物理图称为重叠群，其组建采用染色体步移法。从基因组文库中挑取一个指定的或者随机的克隆，然后寻找与之重叠的另一个依次延伸。2021/6/16482021/6/1649指纹作图在基因组范围内查找重叠的克隆，最好的方法首推克隆指纹排序。指纹系指确定DNA样品所具有的特定DNA片段组成，一个克隆的指纹表示了该克隆具有的限定的顺序特征。2021/6/1650限制性带型指纹限制性酶处理凝胶分离DNA片段部分相同，说明具有重叠的顺序2021/6/1651重复顺序DNA指纹不同克隆的DNA用限制性酶处理杂交具有相同的带型，说明具有相同的重复顺序2021/6/1652重复顺序DNAPCR指纹确定重复顺序之间的单一顺序设计重复顺序互补的引物，进行凝胶分离比较带型差异A平均为4KB，2021/6/1653STS目录作图需要将某一克隆重叠群锚定到现有已具有STS标记的物理图上时，此法有效。根据STS设计引物，凡能扩增出条带的克隆，具有顺序重叠的插入子。2021/6/16542021/6/1655荧光标记原位杂交Fluorescent in situ hybridization , FISH标记信号为荧光素，结果可在显微镜下观察，直接显示探针与染色体杂交的位置。原位杂交：靶子为完整的染色体，由杂交信号提供作图信号，DNA变性时不破坏染色体自然形态，2021/6/16562021/6/16572021/6/1658与同位素探针杂交的区别方法基本一致，探针差异，解决敏感性与分辩率之间的矛盾对于重复顺序的存在，采用预先与重复顺序结合的方法，封闭部分结合点，降低非特异性顺序的干扰2021/6/1659原位杂交的原理及应用对特定探针而言，原位杂交所的中期染色体荧光信号所处的位置与染色体短臂末端的相对距离是不变的，经比例换算可标注在连锁图上。此仅仅应用于确定新发现的标记属于那条染色体原位杂交的分辩率取决于杂交技术及染色体在制备时所处的状态2021/6/1660其它染色体的选用机械伸展的染色体利用离心剪切力使染色体长度增加20倍非中期染色体利用新的方法，使染色体可既松散又保持分辨特征的染色体2021/6/1661顺序标签位点作图限制性作图快速，提供详细的信息，但不适合大基因组重叠群构建程序复杂，费时费力指纹作图对大基因组仍存在问题原位杂交操作困难，资料累积慢，一次实验定位的分子标记不超过34个2021/6/1662STS绘图顺序标签位点或STS（sequence tagged site）为一段长度100500BP的单一DNA顺序，易于分辨。如果两个序列片段含有同一STS，则表示两个序列片段重叠。2个STS出现在同一片段中的机会取决于他们的位置是否靠得近。2021/6/1663STS作图原理2021/6/1664合格的STS特点序列已知在染色体上独一无二2021/6/1665寻找STS办法表达序列标签（expressed sequence tag ,EST)从cDNA克隆中找到小段顺序SSLP 具有多态性并已在连锁分析中定位的SSLP具有特别的价值。随机基因组测序2021/6/1666STS的物理定位辐射杂种克隆作图2021/6/1667辐射杂种含有另一种生物染色体片段的啮齿类细胞人体细胞射线照射，染色体随机断裂，剂量与片段大小成反比。将辐射后细胞与正常仓鼠细胞融合，片段将整合到鼠类细胞染色体中进行扩增。利用胸苷激酶或次黄嘌呤磷酸转移酶的缺陷细胞，采用HAT培养基选择。获得TK和HPRT基因的可生长。一般每个阳性杂种细胞保存DNA占人基因组1530%，510Mb2021/6/16682021/6/1669仅含单个染色体的杂种群含有单个染色体的啮齿类细胞与仓鼠细胞融合利用短分散核因子（short interspersed nuclear element ,SINE)Alu为探针，挑选出含人基因组的杂种细胞。Alu平均4KB就有一个2021/6/1670作图单位：厘镭（centriRay ,cR)DNA分子暴露在射线下两个分子标记之间发生1%断裂的频率。2021/6/16712021/6/1672克隆作图来自于全基因组的克隆库来自于单个染色体2021/6/1673人类基因组物理图2021/6/1674 结束语结束语若有不当之处，请指正，谢谢！若有不当之处，请指正，谢谢！