硝基四氮唑蓝还原试验NitroblueTetrazoliumReductionTest实验原理实验原理这是用于检查机体细胞免疫功能的一种方法。硝基蓝四氮唑，又称四氮唑蓝(nitrobluetetrazolium，NBT)，是一种水溶性的淡黄色活性染料，当其被嗜中性粒细胞的酶还原后，则变为非水溶性的蓝黑色甲臜(Formazan)颗粒，沉淀于胞浆内。当机体受细菌、真菌和寄生虫感染时，嗜中性粒细胞的吞噬能力明显增强，还原NBT的能力亦随之增高，但病毒性感染或非感染性疾病则不增高，故可利用NBT还原试验作为诊断全身性感染的一种辅助方法，并作为判定嗜中性粒细胞杀菌功能的指标，以诊断吞噬功能缺陷症。一般认为在细菌感染过程中，嗜中性粒细胞能量消耗骤增，氧的消耗量增加，己糖磷酸旁路糖代谢活性加强，葡萄糖分解的中间产物葡萄糖6磷酸在此旁路中脱氢氧化而成为戊糖。所脱出的氢被吞入或渗入胞浆内的NBT接受，则还原成为点状或块状的蓝黑色甲臜颗粒，沉积于细胞浆内。 白细胞根据形态差异可分为有颗粒和无颗粒两大类，无颗粒的白细胞有淋巴细胞和单核细胞两种。颗粒白细胞（粒细胞）中含有特殊染色颗粒，用瑞氏-吉姆萨染液可分辨出三种颗粒白细胞即嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。绝大部分的粒细胞是嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞，简称中性粒细胞（neutrophilicgranulocyte），是白细胞中数量最多的，约占全部白细胞的50左右，呈圆形，胞质淡红色，内含有多量的紫红色微粒（不易看清）。胞核随细胞成熟的程度而不同，幼稚型的呈杆状或马蹄形，成熟的呈分叶状，三叶的较多见，老龄的有89叶或更多。嗜酸性粒细胞，(拉丁学名：Eosinophil)：细胞质内含深红色大型颗粒，颗粒内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶。其细胞核的形状与嗜中性白细胞相似，通常有23叶，约占白细胞总数的4。嗜嗜碱碱性性粒粒细细胞胞，数量很少，约占，大小与嗜酸性颗粒细胞基本相同。胞质内含有大的蓝紫色颗粒，胞核也分叶。主要试剂与器材1、待测样本：新鲜肝素抗凝血；2、NBT溶液：取和聚蔗糖20mg，溶于100ml生理盐水中，过滤，分装，4保存备用；3、肝素溶液；4、瑞氏-吉姆萨染液，甲醇，pH7.2PBS，生理盐水等；5、主要器材：采血针，75%酒精棉球，载玻片，湿盒，37恒温箱，显微镜等实验操作方法1、载玻片上滴加20-30ul肝素溶液；2、75%酒精棉球对受试者手指尖消毒，干燥后用采血针针刺，轻柔挤出血，吸取约40-60ul血液，与载玻片上的肝素混匀；3、加入NBT溶液一滴，轻轻吹吸混匀；4、置于湿盒中，放入37恒温箱孵育15min后，转至室温再放置15min，并轻轻摇匀；5、将载玻片上的待检样本制成血涂片（采取推片法），自然晾干；6、滴加瑞氏-吉姆萨染液染色，具体步骤如下：1）平置血涂片于桌面或染色架上，滴加试剂一3-5滴，使其迅速覆盖血膜，染色1分钟，与固定血膜；2）不要丢弃试剂一，直接滴加试剂二6-10滴，轻摇玻片使染色液充分混匀，染色5-8分钟；3）水洗后，待干后镜检。染色结果观察1）红细胞呈浅红色，中央稍淡。2）白细胞系统清晰易分，细胞膜清晰呈紫黑色，细胞核的着色呈深浅不一的紫红色，胞浆呈浅红色。胞浆中的各种颗粒区分明显：（A）中性粒细胞胞浆中颗粒呈紫红色、嗜酸性粒细胞胞浆中颗粒呈桔红色、嗜碱性粒细胞胞浆中颗粒呈蓝褐色；（B）单核细胞的胞浆呈灰蓝色，胞浆中颗粒呈细小淡紫红色或蓝紫色；（C）淋巴细胞胞浆呈淡蓝色。3）凡中性粒细胞胞浆中含有蓝色甲臜颗粒者为NBT阳性细胞，计数100个中性粒细胞，计算NBT阳性中性粒细胞百分率。正常人外周血中性粒细胞NBT阳性率约为10%。注意事项1、推片：取反应溶液1-2滴置载玻片上，将推玻片保持与载玻片30角，置于溶液正前方，稍往后移与溶液接触，可见溶液沿推片下缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳前移，至溶液铺完为止；2、涂片时不要太厚也不要太薄，太厚时红细胞容易重叠并易皱，太薄时又不容易找到白细胞；3、血溶液要干透后才能染色，否则染色时血膜容易脱落；4、染液一和染液二不能过少，以防染液蒸发引起染液沉淀，染液一不可少于400ul，染液二的量是染液一的2倍，滴加染液一和染液二时要轻摇玻片，时溶液迅速布满血膜或使染液迅速而充分地混合；5、镜检时如果红细胞偏蓝，请放在蒸馏水中1-3分钟，直至红润为止；6、如果染色过淡，可复染；染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用75%的乙醇脱色3-5秒钟后，再镜检观察；7、沉着的甲臜颗粒形状不一，有的呈大块状，有的呈点状或放射状。涂片要均匀，以便清楚地看到甲臜沉着物，并能更好地区别嗜中性白细胞及单核细胞。因为单核细胞还原NBT的能力也很强，不应将其计算在NBT阳性细胞内。免疫小鼠抗血清的制备1、采用眼球放血法，每组收集2只免疫小鼠的所有外周血至一洁净干燥的小平皿中，不要放抗凝剂！2、盖上平皿盖，斜置于4冰箱，过夜，待血清充分析出；3、第二天，收集析出的免疫小鼠抗血清，注意要适当剥离和破碎凝血块，充分收集血清至一干净的1.5ml Ep管；4、2500rpm，离心10min，转移上清至另一洁净的1.5ml Ep管，做好标记，保存于-20冰箱备用；如需多次使用，则须分装保存，抗血清要避免反复冻融，否则抗体效价会受到极大影响。