基因芯片技术在环境微生物群基因芯片技术在环境微生物群落研究中的应用落研究中的应用王建福王建福2008243920082439摘要摘要本文按照基因芯片探针的设计方法本文按照基因芯片探针的设计方法, , 将环将环境样品群落研究基因芯片分为系统寡核苷境样品群落研究基因芯片分为系统寡核苷酸芯片、功能基因芯片、群落基因组芯片、酸芯片、功能基因芯片、群落基因组芯片、宏基因组芯片宏基因组芯片, , 并简要综述了该技术在活并简要综述了该技术在活性污泥、土壤、水等环境样品微生物群落性污泥、土壤、水等环境样品微生物群落研究上的应用。研究上的应用。 最后最后, , 本文展望了该技术的研究方向和本文展望了该技术的研究方向和在寻找不同环境微生物群落之间差异微生在寻找不同环境微生物群落之间差异微生物、差异基因或差异表达基因研究中的应物、差异基因或差异表达基因研究中的应用前景。用前景。基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片, , 又称又称DNA DNA 微探针阵列微探针阵列(microarray),(microarray),是一种最重要的生物芯片。是一种最重要的生物芯片。它的工作原理与经典的核酸分子杂交方它的工作原理与经典的核酸分子杂交方法是一致的法是一致的, , 都是应用已知核酸序列作都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交为探针与互补的靶核苷酸序列杂交, , 通通过随后的信号检测进行定性与定量分析。过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片在一微小的基片基因芯片在一微小的基片( (硅片、玻片、硅片、玻片、塑料片等塑料片等) )表面集成了大量的分子识别探表面集成了大量的分子识别探针针, , 能够一次分析大量的基因能够一次分析大量的基因, , 进行大进行大信息量的筛选与检测。信息量的筛选与检测。环境样品及其环境微生物群落研究环境样品及其环境微生物群落研究环境样品包括活性污泥、土壤、水、环境样品包括活性污泥、土壤、水、烟、气溶胶、淤泥、海洋沉积物等。烟、气溶胶、淤泥、海洋沉积物等。而环境微生物群落研究包括环境样品而环境微生物群落研究包括环境样品的微生物分布、种类、功能、动力学的微生物分布、种类、功能、动力学变化及气候、环境污染等环境因素改变化及气候、环境污染等环境因素改变对其微生物生态的影响等。变对其微生物生态的影响等。环境样品群落研究基因芯片的种类环境样品群落研究基因芯片的种类鉴于环境样品的特点鉴于环境样品的特点, , 不是所有种类不是所有种类的基因芯片都适于环境微生物群落研的基因芯片都适于环境微生物群落研究。究。按照基因芯片探针的设计方法按照基因芯片探针的设计方法, , 用于用于环境样品群落研究的基因芯片主要有：环境样品群落研究的基因芯片主要有：系统寡核苷酸芯片、功能基因芯片、系统寡核苷酸芯片、功能基因芯片、群落基因组芯片、宏基因组芯片群落基因组芯片、宏基因组芯片系统寡核苷酸芯片系统寡核苷酸芯片系统寡核苷酸芯片建立在系统标记基因如系统寡核苷酸芯片建立在系统标记基因如rRNA rRNA 基基础之上。础之上。rRNA rRNA 是研究细菌进化和亲源关系的重要是研究细菌进化和亲源关系的重要指标指标, , 是细菌系统分类学最有用和常用的分子钟。是细菌系统分类学最有用和常用的分子钟。16S rRNA16S rRNA是最常用的作为细菌群落结构分析的系是最常用的作为细菌群落结构分析的系统进化标记分子。统进化标记分子。它由多个高度保守的区段和可变区段组成它由多个高度保守的区段和可变区段组成, ,保守性保守性序列基本保守序列基本保守, , 反映生物物种的亲缘关系反映生物物种的亲缘关系, ,因此可因此可以利用恒定区序列设计引物将以利用恒定区序列设计引物将16S rRNA 16S rRNA 片段扩增片段扩增出来出来; ; 高变性则揭示生物物种的特征核酸序列高变性则揭示生物物种的特征核酸序列, , 其序列因不同细菌而异其序列因不同细菌而异, , 因此可利用可变区序列因此可利用可变区序列的差异来设计不同菌属、菌种的探针。的差异来设计不同菌属、菌种的探针。由于由于16SrDNA 16SrDNA 序列在原核生物中的高度保序列在原核生物中的高度保守性守性, , 对于近缘种或同一种内的不同菌株对于近缘种或同一种内的不同菌株之间的鉴别分辩力较差之间的鉴别分辩力较差, ,因此只适于研究因此只适于研究属及属以上水平的菌株。属及属以上水平的菌株。系统寡核苷酸芯片是目前应用最广的一种系统寡核苷酸芯片是目前应用最广的一种基因芯片基因芯片, , 利用该技术已经成功对堆肥、利用该技术已经成功对堆肥、土壤、活性污泥、铀污染含水土层等环境土壤、活性污泥、铀污染含水土层等环境样品进行了微生物检测、菌群动力学、多样品进行了微生物检测、菌群动力学、多样性和结构分析。样性和结构分析。功能基因芯片（功能基因芯片（FGAFGA）功能基因芯片通常建立在催化生化反应的关键功功能基因芯片通常建立在催化生化反应的关键功能基因之上能基因之上, , 这些基因包括了那些与研究对象有这些基因包括了那些与研究对象有确定关系的基因确定关系的基因, , 或至少是与研究对象的关系有或至少是与研究对象的关系有待考证的基因。待考证的基因。作为作为 FGA FGA 候选基因应该具有的特点：候选基因应该具有的特点：(1)(1)该基因该基因是参与生化过程的关键酶或蛋白质编码基因是参与生化过程的关键酶或蛋白质编码基因; (2); (2) 进化保守但在不同微生物之间具有足够的变异进化保守但在不同微生物之间具有足够的变异, , 从而可以对不同菌株设计探针从而可以对不同菌株设计探针; (3); (3)不同的基因在不同的基因在数据库的序列信息量是不同的数据库的序列信息量是不同的, , 应该选择在公共应该选择在公共数据库中具有翔实序列信息的有关基因。数据库中具有翔实序列信息的有关基因。根据根据 FGA FGA 的目的及其杂交靶标的种类的目的及其杂交靶标的种类, , FGA FGA 分为功能分类基因芯片和基因表达芯分为功能分类基因芯片和基因表达芯片。片。 前者的目的主要是研究菌群是否具有这些前者的目的主要是研究菌群是否具有这些特定反应过程及其功能的分布、变化、多特定反应过程及其功能的分布、变化、多样性样性, , 其杂交靶标是菌群其杂交靶标是菌群DNADNA的的PCR PCR 产物。产物。而后者用于研究这些特定功能基因的生理而后者用于研究这些特定功能基因的生理活性及其基因表达情况活性及其基因表达情况, , 需提取环境样品需提取环境样品的的mRNA, mRNA, 其杂交靶标是菌群其杂交靶标是菌群cDNA cDNA 的的PCR PCR 产产物。物。FGA FGA 的探针主要是功能基因的的探针主要是功能基因的PCR PCR 产物产物或合成的寡核苷酸或合成的寡核苷酸, , 其中其中, , 前者通过对前者通过对某些微生物功能基因保守序列设计引物某些微生物功能基因保守序列设计引物, , 从而扩增出相关基因从而扩增出相关基因; ; 而后者是通过数而后者是通过数据库中的序列信息直接设计的。据库中的序列信息直接设计的。目前目前, FGA , FGA 应用推广的限制性瓶颈在于应用推广的限制性瓶颈在于功能基因数据库的不完整性和某些微生功能基因数据库的不完整性和某些微生物的不易培养性。物的不易培养性。群落基因组芯片群落基因组芯片(CGA)(CGA)群落基因组芯片群落基因组芯片(CGA)(CGA)是一种将可培养微生是一种将可培养微生物的全基因组物的全基因组DNA DNA 作为探针的技术作为探针的技术, , 它的它的特异性高特异性高, ,可以鉴定到种甚至菌株水平可以鉴定到种甚至菌株水平; ; 敏敏感性强感性强, , 只需只需0.2 ng0.2 ng的待分析基因组的待分析基因组DNA DNA 就可检测。就可检测。CGA CGA 在微生物检测、鉴定、量化、不同环在微生物检测、鉴定、量化、不同环境样品的微生物菌群相关性或不同微生物境样品的微生物菌群相关性或不同微生物基因组的相关性分析等方面将有着广泛的基因组的相关性分析等方面将有着广泛的前景。前景。宏基因组芯片(MGA)(MGA)未培养微生物组成了地球上生物多样性的未培养微生物组成了地球上生物多样性的主体主体, ,据估计据估计, , 自然环境中超过自然环境中超过99%99%的微生的微生物不能用传统的方法进行纯培养物不能用传统的方法进行纯培养, , 因此因此, , 人们开始通过免培养的技术即宏基因组或人们开始通过免培养的技术即宏基因组或直接从环境样品中抽提克隆微生物的混合直接从环境样品中抽提克隆微生物的混合DNA DNA 来研究环境样品中微生物基因组的功来研究环境样品中微生物基因组的功能和序列分析。能和序列分析。目前目前, , 利用该技术已进行了酸矿外排液和利用该技术已进行了酸矿外排液和Sargasso Sea Sargasso Sea 的微生物群落、活性污泥和的微生物群落、活性污泥和土壤细菌土壤细菌PHB PHB 代谢遗传学等的研究。代谢遗传学等的研究。宏基因组芯片则是一种高通量文库筛选技宏基因组芯片则是一种高通量文库筛选技术术, ,是一种将芯片技术和宏基因组技术结是一种将芯片技术和宏基因组技术结合起来新技术合起来新技术, ,该技术无需分离培养菌株、该技术无需分离培养菌株、无需了解菌群的基因序列。无需了解菌群的基因序列。它的探针来源于环境它的探针来源于环境DNA DNA 的宏基因组文库的宏基因组文库, ,可通过大肠杆菌作为宿主来构建可通过大肠杆菌作为宿主来构建, , 一般来一般来说说, MGA, MGA所包含的探针为所包含的探针为1 kb 1 kb 左右。左右。该技术可以分析环境样品微生物结构和功该技术可以分析环境样品微生物结构和功能能; ;可以通过不同环境样品宏基因组芯片可以通过不同环境样品宏基因组芯片的比较分析获得某环境样品菌群的代表的比较分析获得某环境样品菌群的代表DNA DNA 探针。探针。目前目前, MGA, MGA技术仍在发展初期技术仍在发展初期, , 但由于环但由于环境中存在大量的未知基因序列境中存在大量的未知基因序列, , 因此它在因此它在环境方面将具有巨大的应用价值。环境方面将具有巨大的应用价值。展望展望新功能基因、新功能蛋白的挖掘。新功能基因、新功能蛋白的挖掘。环境样品基因表达谱芯片的建立和环境样品基因表达谱芯片的建立和差异表达基因的寻找。差异表达基因的寻找。环境新监测技术的开发。环境新监测技术的开发。气候对环境微生物群落的影响研究。气候对环境微生物群落的影响研究。