糖原的显色PAS反应（periodic acid schiff reaction）一、制片技术n生物体的组织细胞大部分都是不透明的，不能直接在显微镜下观察，需要切成薄片，必须采用各种特殊的方法对材料进行处理，把材料制成薄片标本，经过染色后，置于显微镜下观察它们的微细结构。石蜡切片n石蜡切片法是组织学常规制片技术中应用最广泛的一种方法，是以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将标本切成薄片，经一系列处理制成永久切片。n制作过程：1.取材2.固定3.洗涤4.脱水5.透明6.浸蜡7.包埋8.切片9.贴片10.脱蜡复水11.染色12.脱水13.透明14.封片。1.取材n从人或动物体内取下所需组织或器官，材料必须新鲜，组织块不宜太大，以便固定剂穿透。2. 固定n目的：迅速凝固蛋白质，终止细胞一切代谢过程，防止组织自溶，保持其活体时结构。n固定剂：10%甲醛、80%酒精、混合固定剂（Bouin氏液、FAA液、Carnoy氏液）。n用量：必须充足，一般为材料块的2030倍。n固定时间：数小时至24小时。3. 洗涤n目的：除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，以免影响后面的染色效果。n方法：多数用流水冲洗，少数用酒精。4.脱水 n目的：固定或洗涤后的组织内充满水分，而水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去，才能进行石蜡包埋。n脱水剂：酒精n方法：从低浓度到高浓度梯度酒精脱水：30%50%70%80%90%95%100%各级酒精中放置1数小时。 水 酒精 石蜡5.透明n目的：酒精与石蜡不相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。组织在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，因此该过程称透明。n透明剂：二甲苯。n方法：酒精二甲苯等量混合液（1：1）15分钟，二甲苯30分钟。 水酒精二甲苯石蜡6.浸蜡n目的：除去组织中的透明剂，使石蜡渗透到组织内部，达到饱和程度以便包埋。n方法：石蜡二甲苯等量混合15分钟，石蜡、石蜡 各30分钟。浸蜡应在高于石蜡熔点3左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内（石蜡的熔点在5060之间）。7.包埋n目的：将浸蜡后的组织块包埋于石蜡中。n方法：取出组织块，置于盛有融化石蜡的包埋框中，迅速放入冷水中冷却，待石蜡完全凝固（约30min）后取出，即做成含有组织块的蜡块标本。8.切片 n将蜡块装在切片机上，调整所需的切片厚度（410um），进行切片，切出一片接一片的蜡带，用刀片割开蜡带。9.贴片 n目的：借助粘附剂将展平的蜡片粘附于载玻片上，以免在以后的操作步骤中脱落。n方法：在洁净的载玻片上涂抹薄层粘附剂（如多聚赖氨酸），滴两滴蒸馏水于载玻片上，把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，将载玻片放入温箱中干燥。10.脱蜡复水 n目的：染色液多数为水溶液，因此染色前必须将组织中的蜡脱去，才能进行染色。n方法：与脱水浸蜡过程正好相反： 二甲苯、30min100%酒精90%酒精80%酒精70%酒精蒸馏水 各2min。 石蜡二甲苯酒精水11.染色 n目的：使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。n经典的HE染色法： 苏木精（Hematoxylin） 伊红（Eosin） 碱性染料 酸性染料 细胞核中的DNA、RNA等 细胞质、膜性结构等嗜碱性物质（本身酸性） 嗜酸性物质（本身碱性） 染成蓝色 染成红色12.脱水 13.透明 14. 封片 n目的：去除水分，透明组织，便于观察和长期保存标本。n方法： 脱水：95%酒精 2分钟100%酒精 2分钟 透明：二甲苯I 2分钟二甲苯II 2分钟 封片：将载玻片从二甲苯中取出放在吸水纸，迅速地在切片的中间滴一滴中性树胶，拿起盖玻片，缓慢倾斜放下，避免产生气泡。取材固定脱水、透明浸蜡、包埋、切片、贴片脱蜡复水染色脱水、透明封片smear stretched preparation ground section 其他制片技术涂片(smear) 铺片(stretched preparation) 磨片(ground section) 过碘酸过碘酸-Schiff反应反应（ periodic acid Schiff reaction , PAS反应）反应）n原原理理：PAS反应是经典的组织化学方法，用来显示组织细胞中的多糖或糖蛋白。原理是含有乙二醇基的糖类，在过碘酸的作用下，经氧化而产生双醛基，醛基进而与亚硫酸品红（Schiff试剂）结合，使无色液体变成紫红色染料，并沉着于含有多糖或糖蛋白的细胞或组织结构上。乙二醇乙二醇PA氧化氧化醛基醛基Schiff试剂试剂紫红色沉淀紫红色沉淀（PAS阳性反应）阳性反应）糖原的显色糖原的显色PAS反应反应n应用：应用：可根据紫红色的位置及深浅鉴定糖成分的分布及相对含量，用于心血管疾病、糖尿病以及某些肿瘤的诊断和研究。糖原的显色糖原的显色PAS反应反应材料：材料：n标本：成年小鼠肝和脾石蜡切片n试剂：1%过碘酸，蒸馏水，亚硫酸品红溶液（Schiff试剂），0.5%偏重亚硫酸盐，苏木精，二甲苯，梯度酒精，中性树胶。n器材：染色缸，烧杯，切片架，盖玻片等。 方法：方法：1.切片脱蜡复水。2.蒸馏水 2min3.过碘酸氧化10分钟4.蒸馏水洗3分钟5.Schiff试剂避光染色10分钟6.亚硫酸盐溶液浸洗3次（I、II、III），每次2分钟7.自来水洗3次，每次1分钟，蒸馏水洗1分钟8.苏木精染色1分30秒9.自来水洗3次，每次1分钟，蒸馏水洗1分钟10.梯度脱水：95%酒精 2分钟100%酒精 2分钟， 透明： 二甲苯I 2分钟二甲苯II 2分钟11.中性树胶封片，显微镜下观察（低倍镜高倍镜）*两人一小组，分别 观察肝和肺切片注意事项：注意事项：1.从前一个缸放入后一个缸之前，要尽量沥干水。2.自来水洗涤方法：将切片架放入洗涤缸中，上下左右晃动洗涤，切不可对着自来水冲洗。3.严格控制好染色、洗涤时间。结果判断：结果判断：n结果：糖原颗粒被Schiff试剂染色呈紫紫红红色色，细胞核被苏木精染色呈蓝蓝色色，其他背景呈淡淡粉粉红色红色。n判断：根据紫红色的颜色深浅和分布多少，判断肝、脾两份标本的PAS染色程度：，+，+，+，+实验报告n1.实验原理n2.材料与方法n3.结果分析小肠上皮 肾小球三、免疫组织化学三、免疫组织化学（immunohistochemistry） 利用抗原（利用抗原（antigen, Ag），），抗体（抗体（antibody）特异特异 结合的原理，用已知抗体检测未知抗原的一种方法。结合的原理，用已知抗体检测未知抗原的一种方法。标记物为荧光素、过标记物为荧光素、过氧化物酶或金颗粒氧化物酶或金颗粒