琥珀酸脱氢酶的作用琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制及其竞争性抑制生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系实实 验验 7实验5琥珀酸脱氢酶AL了解琥珀酸脱氢酶的作用及了解琥珀酸脱氢酶的作用及 酶促反应中的竞争性抑制作用酶促反应中的竞争性抑制作用实实 验验 目目 的的实验5琥珀酸脱氢酶AL竞争性抑制作用竞争性抑制作用抑制剂和底物的结构相似，抑制剂和底物的结构相似，能和酶的底物分子竞争能和酶的底物分子竞争与酶的活性中心相结合，与酶的活性中心相结合，从而阻碍酶与底物结合从而阻碍酶与底物结合形成中间产物。形成中间产物。酶活性位点酶活性位点实验5琥珀酸脱氢酶AL抑制程度取决于抑制剂和底物对酶的相对亲和力抑制程度取决于抑制剂和底物对酶的相对亲和力 以及抑制剂和底物浓度比。以及抑制剂和底物浓度比。加大底物浓度可减弱甚至解除抑制作用。加大底物浓度可减弱甚至解除抑制作用。实验5琥珀酸脱氢酶AL实实 验验 原原 理理延胡索酸延胡索酸琥珀酸琥珀酸还原型甲烯蓝还原型甲烯蓝(白白)琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶甲烯蓝甲烯蓝(蓝蓝)E + S ES E + P琥珀酸琥珀酸丙二酸丙二酸E+IEI琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶FAD FADH2实验5琥珀酸脱氢酶AL操操 作作 步步 骤骤 1、酶提取液的制备、酶提取液的制备 11.3 g 兔肌肉兔肌肉(剪碎剪碎)海砂少许海砂少许(1/3匙匙) +2ml 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(1/15 mol/L)，研磨成糊状，研磨成糊状， 然后再加然后再加10ml 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(1/15 mol/L)混匀。混匀。2、纱布过滤（双层）、纱布过滤（双层）3、取小试管五只，按书上、取小试管五只，按书上P40表格加入各试剂。表格加入各试剂。 最后加石蜡隔绝空气，最后加石蜡隔绝空气，37水浴保温。水浴保温。 每间隔每间隔1015min观察一次结果，并记录。观察一次结果，并记录。实验5琥珀酸脱氢酶AL实实 验验 结结 果果编号号12345酶酶有有有有有有有有无无底物底物+抑制抑制剂-+-结果果实验5琥珀酸脱氢酶AL实验5琥珀酸脱氢酶AL注注 意意 事事 项项注意区分肌肉与筋膜；注意区分肌肉与筋膜；家兔肌肉必须充分剪碎碾磨，海砂不可加太多；家兔肌肉必须充分剪碎碾磨，海砂不可加太多；12 ml缓冲液要分次加入，不可一次性加入；缓冲液要分次加入，不可一次性加入；碾磨器械、纱布要及时清洗，纱布要洗干净晾干；碾磨器械、纱布要及时清洗，纱布要洗干净晾干；滴加试剂时，一定要看清试剂的名称和浓度；滴加试剂时，一定要看清试剂的名称和浓度；滴加液体石蜡时沿着管壁倾斜加入，盖住液面即可；滴加液体石蜡时沿着管壁倾斜加入，盖住液面即可；观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝；观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝；实验完成后试管要用皂粉清洗。实验完成后试管要用皂粉清洗。实验5琥珀酸脱氢酶AL改良改良Mohum法测定法测定鼠肝谷鼠肝谷-丙转氨酶丙转氨酶(GPT)活性活性实实 验验 22实验5琥珀酸脱氢酶AL实实 验验 目目 的的 掌握掌握GPT活性测定的基本原理活性测定的基本原理熟悉熟悉GPT活性测定的具体操作方法活性测定的具体操作方法了解血清了解血清GPT活性测定的临床意义活性测定的临床意义实验5琥珀酸脱氢酶AL实实 验验 原原 理理GPT2,4-二硝基苯二硝基苯丙氨酸丙氨酸丙酮酸丙酮酸 -酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸在在520nm波长测定其光密度，与已知浓度的丙酮波长测定其光密度，与已知浓度的丙酮酸溶液比较，即可计算谷酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性丙转氨酶的活性丙酮酸二硝基苯丙酮酸二硝基苯（碱性溶液中呈棕色）（碱性溶液中呈棕色）实验5琥珀酸脱氢酶AL血清谷血清谷- -丙转氨酶活性单位丙转氨酶活性单位在在pH 7.4、37条件下，条件下，每毫升肝匀浆与底物保温每毫升肝匀浆与底物保温30min后，后，每生成每生成2.5 g的丙酮酸作为的丙酮酸作为1个谷个谷-丙转氨酶的活性单位，丙转氨酶的活性单位，血清中血清中GPT正常值为正常值为2-40 U/mL。实验5琥珀酸脱氢酶AL实实 验验 步步 骤骤标准管法测定酶活性：标准管法测定酶活性：1、取干燥试管、取干燥试管4支，标号支，标号 测定管测定管 对照管对照管 标准管标准管 空白管空白管2、依次加入试剂，混匀，、依次加入试剂，混匀，37保温保温3、呈色反应后，、呈色反应后，520nm比色测比色测OD值值实验5琥珀酸脱氢酶AL谷丙转氨酶活性单位谷丙转氨酶活性单位/mL鼠肝匀浆鼠肝匀浆 = ? U/ml 方法一：以空白管调方法一：以空白管调0，测，测A测定测定、A标准标准、A对照对照实实 验验 结结 果果 A测定测定测定管中生成丙酮酸的质量测定管中生成丙酮酸的质量 = m标准标准 A标准标准 A对照对照对照管中生成丙酮酸的质量对照管中生成丙酮酸的质量 = m标准标准 A标准标准30min中生成丙酮酸的质量中生成丙酮酸的质量 = m测定测定 m对照对照 A测定测定-A对照对照 = m标准标准 A标准标准 30min生成丙酮酸的质量生成丙酮酸的质量 1活性单位活性单位 = 2.5 g V测定测定实验5琥珀酸脱氢酶AL方法二：以空白管调方法二：以空白管调0，测，测A标准标准 以对照管调以对照管调0，测，测A测定测定 A测定测定 m标准标准 1 A标准标准活性单位活性单位 = (U/ml) 2.5 g V测定测定实验5琥珀酸脱氢酶AL注注 意意 事事 项项1保温温度和时间要精确，即酶发挥催化作用的保温温度和时间要精确，即酶发挥催化作用的环境要一致。环境要一致。2 掌握酶活性单位的概念和计算方法掌握酶活性单位的概念和计算方法3 微量移液器的使用微量移液器的使用实验5琥珀酸脱氢酶AL分光光度计的使用分光光度计的使用1. 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热2030min2. 1档（空白管），档（空白管），T模式调模式调100%，显示，显示“Blank”、“100”3. 拉杆拉至拉杆拉至1.5档，档，T模式下调模式下调0%，显示，显示“0.00”4. 换到换到A模式，拉至模式，拉至2、3、4档，读取各个样品的吸光度档，读取各个样品的吸光度拉杆，拉杆，1-4档档样品池样品池读数读数波长波长毛面毛面光面光面1、分清光面、毛面。手应接触毛面，光线从光面通过、分清光面、毛面。手应接触毛面，光线从光面通过2、用溶液润洗、用溶液润洗2-3次，装至次，装至2/3至至4/5体积体积3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面、粗纸吸水、柔纸擦亮光面比色杯比色杯实验5琥珀酸脱氢酶ALALT测定的临床意义测定的临床意义用本法测定血用本法测定血ALT正常值为正常值为40 U/ml以下以下肝细胞中肝细胞中ALT最丰富，当肝脏疾病致肝细胞受损时，最丰富，当肝脏疾病致肝细胞受损时，ALT即大量释放入血液，致使血清中即大量释放入血液，致使血清中ALT活性增高。活性增高。测定测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。是检查肝功能的重要指标之一。显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死；显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死；中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎；中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎；轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。饮酒、油腻饮食、过劳等因素也会导致饮酒、油腻饮食、过劳等因素也会导致ALT短暂增高短暂增高实验5琥珀酸脱氢酶AL实验5琥珀酸脱氢酶AL