病毒感染的检查方法病毒感染的检查方法与防治原则与防治原则中南大学湘雅医学院中南大学湘雅医学院姚孟晖姚孟晖 副教授副教授第第2525章章 第一节第一节 病毒感染的检查病毒感染的检查病毒感染的检查病毒感染的检查检测内容检测内容查病毒查病毒查特异性查特异性抗体抗体 病毒颗粒病毒颗粒 病毒抗原病毒抗原 病毒核酸病毒核酸 病毒酶类：如逆转录酶病毒酶类：如逆转录酶 电镜直接观察电镜直接观察 光镜检查包含体光镜检查包含体 分离培养分离培养一、标本的采集与送检一、标本的采集与送检原则基本与细菌相似原则基本与细菌相似，但，但应注意：应注意： 1.1.标本用标本用“双抗双抗”或两性霉素或两性霉素B B处理处理 ，尽快送检尽快送检 二、病毒的分离与鉴定二、病毒的分离与鉴定（一）病毒的分离培养（一）病毒的分离培养 细胞培养细胞培养（cell culture） 鸡胚接种鸡胚接种（egg inoculation） 动物接种动物接种（animal inoculation）二、病毒的分离与鉴定二、病毒的分离与鉴定一般程序：一般程序：标本标本标本标本无菌处理无菌处理无菌处理无菌处理动物接种动物接种动物接种动物接种鸡胚培养鸡胚培养鸡胚培养鸡胚培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养指标指标指标指标阳性阳性阳性阳性指标指标指标指标阴性阴性阴性阴性 病毒鉴定病毒鉴定病毒鉴定病毒鉴定 盲传盲传盲传盲传2 2 2 23 3 3 3代代代代指标阴性指标阴性指标阴性指标阴性病毒阴性病毒阴性病毒阴性病毒阴性（一）病毒的分离培养（一）病毒的分离培养 1.1.细胞培养细胞培养 单层细胞培养单层细胞培养单层细胞培养单层细胞培养（monolayer cell culturemonolayer cell culture） 分类分类 悬浮细胞培养悬浮细胞培养悬浮细胞培养悬浮细胞培养（suspended cell culturesuspended cell culture） 原代细胞原代细胞原代细胞原代细胞（primary cellprimary cell）细胞种类细胞种类 二倍体细胞（二倍体细胞（二倍体细胞（二倍体细胞（diploid celldiploid cell） 传代细胞系传代细胞系传代细胞系传代细胞系（continuous cell linecontinuous cell line）病毒的细胞培养病毒的细胞培养细胞培养瓶细胞培养瓶细胞培养瓶细胞培养瓶单层细胞单层细胞单层细胞单层细胞1.1.细胞培养细胞培养(1)(1)原代和次代细胞培养原代和次代细胞培养组织组织 组织块组织块 分散的单个细胞分散的单个细胞 单层细胞单层细胞 剪碎剪碎 培养基培养基( ( ( (原代细胞原代细胞原代细胞原代细胞) ) ) )单层细胞单层细胞单层细胞单层细胞( ( ( (次代细胞次代细胞次代细胞次代细胞) ) ) )传代培养传代培养传代培养传代培养蛋白酶蛋白酶 特点特点：对多种病毒敏感对多种病毒敏感 生长能力有限生长能力有限, , 获取成本高获取成本高 可携带潜伏病毒可携带潜伏病毒1.1.细胞培养细胞培养(1)(1)原代和次代细胞培养原代和次代细胞培养(2)(2)二倍体细胞培养二倍体细胞培养 体外分裂体外分裂体外分裂体外分裂50505050100100100100代仍保持二倍体染色体代仍保持二倍体染色体代仍保持二倍体染色体代仍保持二倍体染色体数目数目数目数目，可用于病毒分离和疫苗生产可用于病毒分离和疫苗生产可用于病毒分离和疫苗生产可用于病毒分离和疫苗生产。特点特点：对多种病毒敏感对多种病毒敏感 不带异种蛋白不带异种蛋白( (人源性人源性) ) 不带病毒不带病毒，无致瘤潜能无致瘤潜能 可传可传5050代左右代左右1.1.细胞培养细胞培养(3) (3) 传代细胞培养传代细胞培养特点特点特点特点：对多种病毒敏感性高对多种病毒敏感性高对多种病毒敏感性高对多种病毒敏感性高 繁殖能力高繁殖能力高繁殖能力高繁殖能力高，传代时间长传代时间长传代时间长传代时间长 有致癌危险，不能用于疫苗生产有致癌危险，不能用于疫苗生产有致癌危险，不能用于疫苗生产有致癌危险，不能用于疫苗生产1.1.细胞培养细胞培养 采用孵化采用孵化采用孵化采用孵化9 91414天的鸡胚天的鸡胚天的鸡胚天的鸡胚 绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜（allantocherionallantocherion） 痘苗病毒、人类疱疹病毒痘苗病毒、人类疱疹病毒痘苗病毒、人类疱疹病毒痘苗病毒、人类疱疹病毒 尿囊腔尿囊腔尿囊腔尿囊腔（allantoic cavityallantoic cavity）接种部位接种部位接种部位接种部位 流感病毒、腮腺炎病毒流感病毒、腮腺炎病毒流感病毒、腮腺炎病毒流感病毒、腮腺炎病毒 羊膜腔羊膜腔羊膜腔羊膜腔（amniotic cavityamniotic cavity） 流感病毒的初次分离流感病毒的初次分离流感病毒的初次分离流感病毒的初次分离 卵黄囊卵黄囊卵黄囊卵黄囊（yolk sacyolk sac） 嗜神经病毒嗜神经病毒嗜神经病毒嗜神经病毒 2 2、鸡胚培养、鸡胚培养优点：优点：易管理易管理，不带微生物不带微生物，成本较低成本较低缺点：缺点：操作程序复杂操作程序复杂 应用：应用：应用：应用：尚无敏感细胞的病毒培养尚无敏感细胞的病毒培养尚无敏感细胞的病毒培养尚无敏感细胞的病毒培养 动物：动物：动物：动物：兔、鼠、黑猩猩、猴等兔、鼠、黑猩猩、猴等兔、鼠、黑猩猩、猴等兔、鼠、黑猩猩、猴等 优点：优点：优点：优点：结果易观察，可建立动物模型结果易观察，可建立动物模型结果易观察，可建立动物模型结果易观察，可建立动物模型 缺点：缺点：缺点：缺点：有饲养条件要求，费用高有饲养条件要求，费用高有饲养条件要求，费用高有饲养条件要求，费用高，动物动物动物动物 体内常带有潜伏病毒体内常带有潜伏病毒体内常带有潜伏病毒体内常带有潜伏病毒1 1病毒增殖鉴定病毒增殖鉴定 (1)(1)(1)(1)细细细细 胞胞胞胞 病病病病 变变变变 效效效效 应应应应 （ cytopathcytopathicic effect,effect, CPE CPE ） 细细细细胞胞胞胞变变变变圆圆圆圆、聚聚聚聚集集集集、坏坏坏坏死死死死、溶溶溶溶解解解解或脱落等（多数病毒）或脱落等（多数病毒）或脱落等（多数病毒）或脱落等（多数病毒）； 形形形形成成成成多多多多核核核核巨巨巨巨细细细细胞胞胞胞或或或或称称称称融融融融合合合合细细细细胞胞胞胞（麻麻麻麻疹疹疹疹病病病病毒毒毒毒、巨巨巨巨细细细细胞胞胞胞病病病病毒毒毒毒、呼呼呼呼吸吸吸吸道道道道合合合合胞病毒胞病毒胞病毒胞病毒等）等）等）等）； 在在在在培培培培养养养养细细细细胞胞胞胞中中中中形形形形成成成成包包包包涵涵涵涵体体体体（狂狂狂狂犬病病毒、麻疹病毒等犬病病毒、麻疹病毒等犬病病毒、麻疹病毒等犬病病毒、麻疹病毒等）。）。）。）。 （二）病毒的鉴定（二）病毒的鉴定 细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落( (1 1) )细胞病变效应细胞病变效应( (cytopathic effect, CPE) )麻疹病毒麻疹病毒麻疹病毒麻疹病毒感染细胞感染细胞感染细胞感染细胞呼吸道合胞病呼吸道合胞病呼吸道合胞病呼吸道合胞病毒感染细胞毒感染细胞毒感染细胞毒感染细胞形成多核巨细胞或称融合细胞形成多核巨细胞或称融合细胞形成多核巨细胞或称融合细胞形成多核巨细胞或称融合细胞( (1 1) )细胞病变效应细胞病变效应( (cytopathic effect, CPE) )形成包涵体形成包涵体形成包涵体形成包涵体( ( ( (inclusion bodyinclusion bodyinclusion bodyinclusion body) ) ) )( (1 1) )细胞病变效应细胞病变效应( (cytopathic effect, CPE) )腮腺炎病毒感染细胞腮腺炎病毒感染细胞腮腺炎病毒感染细胞腮腺炎病毒感染细胞( (2 2) )红细胞吸附红细胞吸附（hemadsorption）病毒病毒病毒病毒囊囊囊囊膜表面血凝素膜表面血凝素膜表面血凝素膜表面血凝素( ( ( (HAHAHAHA) ) ) )红细胞红细胞红细胞红细胞表面表面表面表面HAHAHAHA受体受体受体受体( (3 3) )干扰现象干扰现象（interference）风疹病毒风疹病毒风疹病毒风疹病毒人胚肾细胞人胚肾细胞人胚肾细胞人胚肾细胞 病毒增殖，病毒增殖，病毒增殖，病毒增殖，CPECPECPECPE( ( ( () ) ) )埃可病毒埃可病毒埃可病毒埃可病毒人胚肾细胞人胚肾细胞人胚肾细胞人胚肾细胞 病毒增殖，病毒增殖，病毒增殖，病毒增殖，CPECPECPECPE( ( ( () ) ) )人胚肾细胞人胚肾细胞人胚肾细胞人胚肾细胞风疹病毒风疹病毒风疹病毒风疹病毒？埃可病毒埃可病毒埃可病毒埃可病毒CPE(-)CPE(-)CPE(-)CPE(-)风疹病毒风疹病毒风疹病毒风疹病毒( ( ( (+)+)+)+) 埃可病毒埃可病毒埃可病毒埃可病毒(-)(-)(-)(-)CPE(+)CPE(+)CPE(+)CPE(+)风疹病毒风疹病毒风疹病毒风疹病毒(-)(-)(-)(-) 埃可病毒埃可病毒埃可病毒埃可病毒(+)(+)(+)(+)( (4 4) )细胞代谢改变细胞代谢改变 细胞代谢变慢细胞代谢变慢细胞代谢变慢细胞代谢变慢 pHpH变化减慢变化减慢变化减慢变化减慢2 2. .病毒形态学鉴定病毒形态学鉴定电子显微镜电子显微镜电子显微镜电子显微镜：设备、操作复杂，：设备、操作复杂，：设备、操作复杂，：设备、操作复杂，应用受限应用受限应用受限应用受限光学显微镜光学显微镜光学显微镜光学显微镜：可见：可见：可见：可见大病毒大病毒大病毒大病毒（痘类病毒），痘类病毒），痘类病毒），痘类病毒）， 对一般病毒检测对一般病毒检测对一般病毒检测对一般病毒检测意义不大意义不大意义不大意义不大3 3. .病毒血清学鉴定病毒血清学鉴定 鉴定病毒种、型、亚型鉴定病毒种、型、亚型鉴定病毒种、型、亚型鉴定病毒种、型、亚型 ( ( ( (1 1 1 1) ) ) )血凝抑制试验血凝抑制试验血凝抑制试验血凝抑制试验（hemagglutinatihemagglutination on i inhibition testnhibition test）正粘正粘正粘正粘病毒型与亚型鉴定病毒型与亚型鉴定病毒型与亚型鉴定病毒型与亚型鉴定 病毒病毒病毒病毒鸡鸡鸡鸡红细胞红细胞红细胞红细胞凝集凝集凝集凝集（血凝试验）（血凝试验）（血凝试验）（血凝试验） 病毒病毒病毒病毒特异性抗体特异性抗体特异性抗体特异性抗体鸡鸡鸡鸡红细胞红细胞红细胞红细胞不凝集不凝集不凝集不凝集 （血凝抑制试验血凝抑制试验血凝抑制试验血凝抑制试验） (2)(2)(2)(2)免疫标记法免疫标记法免疫标记法免疫标记法（FIAFIAFIAFIA、EIAEIAEIAEIA、RIARIARIARIA） 多种病毒鉴定多种病毒鉴定多种病毒鉴定多种病毒鉴定( ( ( (3 3 3 3) ) ) )凝胶免疫扩散试验凝胶免疫扩散试验凝胶免疫扩散试验凝胶免疫扩散试验( ( ( (gel immunogel immuno- - diffusiondiffusion testtest) ) ) ) 多种病毒鉴定多种病毒鉴定多种病毒鉴定多种病毒鉴定3 3. .病毒血清学鉴定病毒血清学鉴定4 4. .病毒分子生物学鉴定病毒分子生物学鉴定抗原变异病毒基因的鉴定抗原变异病毒基因的鉴定 核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增 核酸杂交核酸杂交核酸杂交核酸杂交 基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片 基因测序基因测序基因测序基因测序（三）病毒数量与感染性测定（三）病毒数量与感染性测定1 1 1 1. . . .血凝试验：病毒总量（活病毒血凝试验：病毒总量（活病毒血凝试验：病毒总量（活病毒血凝试验：病毒总量（活病毒死病毒）死病毒）死病毒）死病毒） （plaque formation testplaque formation test） 3 3 3 3. . . .50505050组织细胞感染量组织细胞感染量组织细胞感染量组织细胞感染量 （5050 tissue culturetissue culture infectious dose, infectious dose, TCIDTCID5050）感染性病毒量感染性病毒量( (四四) ) 新病毒的鉴定新病毒的鉴定核酸类型的测定核酸类型的测定 理化性状的检测理化性状的检测 形态学鉴定形态学鉴定 血清学鉴定血清学鉴定 基因测序和生物对比基因测序和生物对比三、病毒感染的血清学诊断三、病毒感染的血清学诊断应用应用：采取标本分离病毒为时已晚采取标本分离病毒为时已晚采取标本分离病毒为时已晚采取标本分离病毒为时已晚目目目目前前前前尚尚尚尚无无无无分分分分离离离离此此此此病病病病毒毒毒毒的的的的方方方方法法法法或或或或难难难难以以以以分分分分离的病毒离的病毒离的病毒离的病毒为证实所分离的病毒的临床意义为证实所分离的病毒的临床意义为证实所分离的病毒的临床意义为证实所分离的病毒的临床意义进行血清流行病学调查等进行血清流行病学调查等进行血清流行病学调查等进行血清流行病学调查等1 1. .中和试验中和试验（neutralizing test）病毒病毒病毒病毒中和抗体中和抗体中和抗体中和抗体 病毒失去感染性病毒失去感染性病毒失去感染性病毒失去感染性 特点：特点：特点：特点：特异性高，抗体维持时间长特异性高，抗体维持时间长特异性高，抗体维持时间长特异性高，抗体维持时间长应用：应用：应用：应用：人群免疫情况的调查人群免疫情况的调查人群免疫情况的调查人群免疫情况的调查 临床诊断少用临床诊断少用临床诊断少用临床诊断少用2.2.补体结合试验补体结合试验 （complement fixation test） 用用用用已已已已知知知知病病病病毒毒毒毒可可可可溶溶溶溶性性性性补补补补体体体体抗抗抗抗原原原原检检检检测测测测病病病病人人人人血血血血清中相应的补体抗体清中相应的补体抗体清中相应的补体抗体清中相应的补体抗体 特点：特点：特点：特点：特异性低，抗体出现早，消失快特异性低，抗体出现早，消失快特异性低，抗体出现早，消失快特异性低，抗体出现早，消失快 应用：应用：应用：应用：近期感染指标。近期感染指标。近期感染指标。近期感染指标。四、病毒感染的快速诊断四、病毒感染的快速诊断数小时内出结果数小时内出结果数小时内出结果数小时内出结果病毒颗粒病毒颗粒病毒颗粒病毒颗粒病毒成分（抗原或核酸）病毒成分（抗原或核酸）病毒成分（抗原或核酸）病毒成分（抗原或核酸） 早期抗体检测早期抗体检测早期抗体检测早期抗体检测（I IgMgM）（一）（一）形态学检查形态学检查电镜和免疫电镜检查电镜和免疫电镜检查 普通光学显微镜检查普通光学显微镜检查 包涵体包涵体（二）（二）病毒成分检测病毒成分检测1 1 1 1. . . .病毒蛋白抗原检测病毒蛋白抗原检测病毒蛋白抗原检测病毒蛋白抗原检测 免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术2 2 2 2. . . .病毒核酸检测病毒核酸检测病毒核酸检测病毒核酸检测 核酸扩增技术核酸扩增技术核酸扩增技术核酸扩增技术 核酸杂交技术核酸杂交技术核酸杂交技术核酸杂交技术 基因芯片技术基因芯片技术基因芯片技术基因芯片技术 基因测序基因测序基因测序基因测序（三三）早期抗体检测早期抗体检测 可诊断急性感染可诊断急性感染可诊断急性感染可诊断急性感染 特异性特异性特异性特异性IgMIgM抗体抗体抗体抗体：孕妇感染风疹病毒孕妇感染风疹病毒孕妇感染风疹病毒孕妇感染风疹病毒 EBVEBV早期抗原早期抗原早期抗原早期抗原抗体抗体抗体抗体 EAVEAV核心抗原核心抗原核心抗原核心抗原抗体抗体抗体抗体 早期抗原的抗体早期抗原的抗体早期抗原的抗体早期抗原的抗体 EAVEAV衣壳抗原衣壳抗原衣壳抗原衣壳抗原抗体抗体抗体抗体第二节第二节 病毒感染的特异性预防病毒感染的特异性预防 微生物及其代谢产物微生物及其代谢产物微生物及其代谢产物微生物及其代谢产物 生物制品生物制品生物制品生物制品 动物免疫血清动物免疫血清动物免疫血清动物免疫血清（biological productsbiological products） 免疫细胞免疫细胞免疫细胞免疫细胞 细胞因子细胞因子细胞因子细胞因子 防治和诊断感染性疾病防治和诊断感染性疾病防治和诊断感染性疾病防治和诊断感染性疾病灭活疫苗灭活疫苗灭活疫苗灭活疫苗（inactivated vaccineinactivated vaccine）活疫苗活疫苗活疫苗活疫苗（living vaccineliving vaccine）重组载体疫苗重组载体疫苗重组载体疫苗重组载体疫苗（recombinant carrier vaccinerecombinant carrier vaccine）亚单位疫苗亚单位疫苗亚单位疫苗亚单位疫苗（subunit vaccinesubunit vaccine） 化学提取或人工合成疫苗化学提取或人工合成疫苗化学提取或人工合成疫苗化学提取或人工合成疫苗 重组疫苗重组疫苗重组疫苗重组疫苗（recombinant vaccinerecombinant vaccine）核酸疫苗核酸疫苗核酸疫苗核酸疫苗（nucleic acid vaccinenucleic acid vaccine）一、人工主动免疫常用生物制品一、人工主动免疫常用生物制品二、人工被动免疫常用生物制品二、人工被动免疫常用生物制品 免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白 血清丙种球蛋白血清丙种球蛋白血清丙种球蛋白血清丙种球蛋白 细胞免疫制剂细胞免疫制剂细胞免疫制剂细胞免疫制剂 IFN-IFN- 、 、 细胞因子细胞因子细胞因子细胞因子 IL-2 IL-2、IL-6IL-6、IL-12 IL-12 TNF TNF 、CSFCSF 淋巴因子激活的杀伤细胞淋巴因子激活的杀伤细胞淋巴因子激活的杀伤细胞淋巴因子激活的杀伤细胞 LAKLAK细胞细胞细胞细胞 第三节第三节 病毒感染的治疗病毒感染的治疗 核苷类药物核苷类药物 非核苷类反转录酶抑制剂非核苷类反转录酶抑制剂 蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂 其他抗病毒药物其他抗病毒药物 干扰素和干扰素诱生剂干扰素和干扰素诱生剂 中草药中草药 基因治疗剂基因治疗剂 治疗性疫苗治疗性疫苗 抗病化学制剂抗病化学制剂抗病化学制剂抗病化学制剂反义寡核苷酸反义寡核苷酸反义寡核苷酸反义寡核苷酸干扰干扰RNA核核核核酶酶酶酶（ribozymeribozyme） 核苷类药物作用机制 HSV/VZV HSV/VZV 无环鸟苷无环鸟苷（NA）病毒胸苷激酶病毒胸苷激酶 NA一磷酸宿主细胞激酶 NA三磷酸 （缺乏糖环3-OH基）病毒DNA聚合酶 核酸链延伸被迫终止核酸链延伸被迫终止思考题思考题1.分离病毒的标本和作血清学诊断的标本各有何要求？2.常用组织培养法有几种？各有何应用？3.病毒在组织细胞中增殖的指标是什么？4.病毒性感染的快速诊断方法有哪些？5.预防病毒性感染有哪些人工自动免疫制剂？6.诊断病毒的核酸技术有哪些？