一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”1.1.来源：主要从原核生物中分离纯化出来，它是一类酶，不来源：主要从原核生物中分离纯化出来，它是一类酶，不是一种酶。是一种酶。2.2.化学本质：蛋白质。化学本质：蛋白质。3.3.作用特点作用特点(1)(1)具有专一性。具体表现在如下两个方面：具有专一性。具体表现在如下两个方面：识别双链识别双链DNADNA分子中特定的核苷酸序列。分子中特定的核苷酸序列。切割特定序列中的特定位点。切割特定序列中的特定位点。(2)(2)可用于可用于DNADNA的切割获取目的基因和切割载体。的切割获取目的基因和切割载体。4.4.切割的部位：磷酸二酯键。切割的部位：磷酸二酯键。5.5.产物：黏性末端和平末端。产物：黏性末端和平末端。(1)(1)黏性末端：是限制性核酸内切酶在识别序列的中心轴线黏性末端：是限制性核酸内切酶在识别序列的中心轴线两侧将两侧将DNADNA的两条链分别切开时形成的两条链分别切开时形成( (错位切错位切) )，如图所示：，如图所示： (2)(2)平末端：是限制酶在识别序列的中心轴线处切开时形成平末端：是限制酶在识别序列的中心轴线处切开时形成的的( (平切平切) )，如图所示：，如图所示： 不同不同DNADNA分子用同一种限制酶切割形成的黏分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个性末端都相同；同一个DNADNA分子用不同限制酶切割，产生的分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。另外，不同限制酶切割形成的黏性末黏性末端一般不相同。另外，不同限制酶切割形成的黏性末端，如互补则可以相互重新配对。端，如互补则可以相互重新配对。限制酶的识别序列与被作用的限制酶的识别序列与被作用的DNADNA序列是不同的。前者一序列是不同的。前者一般由般由6 6个核苷酸组成，少数由个核苷酸组成，少数由4 4、5 5或或8 8个核苷酸组成；后者是个核苷酸组成；后者是双链序列。双链序列。判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是：将判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是：将黏性末端旋转黏性末端旋转180180，应该是完全相同的结构。，应该是完全相同的结构。【典例典例1 1】限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNADNA分子分子上特定的核苷酸序列。如图为四种限制酶上特定的核苷酸序列。如图为四种限制酶BamHBamH，EcoREcoR，HindHind以及以及Bgl Bgl 的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNADNA片段末端片段末端可以互补黏合，其正确的末端互补序列应该为可以互补黏合，其正确的末端互补序列应该为 A.BamHA.BamH和和EcoREcoR；末端互补序列；末端互补序列-AATT-AATT-B.BamHB.BamH和和HindHind；末端互补序列；末端互补序列-GATC-GATC-C.EcoRC.EcoR和和HindHind；末端互补序列；末端互补序列-AATT-AATT-D.BamHD.BamH和和BglBgl；末端互补序列；末端互补序列-GATC-GATC- 【解题关键解题关键】首先要明确不同的限制酶有特定的识别首先要明确不同的限制酶有特定的识别序列，其次要分析切割下的黏性末端能否互补，另外要注意序列，其次要分析切割下的黏性末端能否互补，另外要注意互补序列的正确书写。互补序列的正确书写。【标准解答标准解答】选选D D。A A项中项中BamHBamH酶切出的末端序列为酶切出的末端序列为-GATC-GATC-，EcoREcoR酶切出的末端序列为酶切出的末端序列为-AATT-AATT-，两者不互补；，两者不互补；B B项项HindHind酶切出的末端序列为酶切出的末端序列为-AGCT-AGCT-，与，与BamHBamH酶切出的酶切出的末端序列不互补；同理可推，末端序列不互补；同理可推，C C项中也不互补，只有项中也不互补，只有D D项中才项中才互补。互补。二、二、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”1.1.作用的化学键：磷酸二酯键。作用的化学键：磷酸二酯键。2.2.作用目的：将切下的黏性末端或平末端重新拼接、缝合，作用目的：将切下的黏性末端或平末端重新拼接、缝合，形成新的形成新的DNADNA分子。分子。3.DNA3.DNA连接酶与限制性核酸内切酶的比较连接酶与限制性核酸内切酶的比较(1)(1)区别区别(2)(2)两者的关系可表示为：两者的关系可表示为： 4.DNA4.DNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶的比较聚合酶的比较 DNA DNA连接酶无识别的特异性，凡两个黏性末连接酶无识别的特异性，凡两个黏性末端端( (或平末端或平末端) )能互补配对，能互补配对，DNADNA连接酶就能催化其相互缝合，连接酶就能催化其相互缝合，重新形成重新形成DNADNA分子。分子。DNADNA连接酶的活性发挥受温度、连接酶的活性发挥受温度、pHpH等因素的影响。等因素的影响。【典例典例2 2】下列有关下列有关DNADNA连接酶的叙述正确的是连接酶的叙述正确的是催化具有相同的黏性末端的催化具有相同的黏性末端的DNADNA片段之间连接片段之间连接催化具有不同的黏性末端的催化具有不同的黏性末端的DNADNA片段之间连接片段之间连接催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成催化脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键的形成催化脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键的形成A. B.A. B.C. D.C. D. 【解题关键解题关键】本题解题关键是通过比较选项的不同点，本题解题关键是通过比较选项的不同点，并结合并结合DNADNA连接酶的作用机理即作用部位是磷酸二酯键，作连接酶的作用机理即作用部位是磷酸二酯键，作用对象是相同的黏性末端来进行分析。用对象是相同的黏性末端来进行分析。【标准解答标准解答】选选C C。DNADNA连接酶催化相同连接酶催化相同( (即互补即互补) )的黏性末端的黏性末端进行连接，而不是不同的黏性末端的任意连接。进行连接，而不是不同的黏性末端的任意连接。DNADNA连接酶连接酶作用的部位是磷酸二酯键，不是氢键。作用的部位是磷酸二酯键，不是氢键。三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”1.1.载体的作用载体的作用(1)(1)用它作为运载工具，将目的基因送入受体细胞中去。用它作为运载工具，将目的基因送入受体细胞中去。(2)(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。2.2.载体必须具备三个条件载体必须具备三个条件(1)(1)能在受体细胞内稳定保存并大量复制。能在受体细胞内稳定保存并大量复制。(2)(2)有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。(3)(3)具有某些标记基因，以便进行筛选。具有某些标记基因，以便进行筛选。当然，载体应对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到当然，载体应对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。损伤甚至死亡。 3.3.载体的种类载体的种类(1)(1)细菌质粒，它是细菌拟核细菌质粒，它是细菌拟核DNADNA以外的小型环状以外的小型环状DNADNA，有的，有的细菌只有一个，有的细菌有多个。细菌只有一个，有的细菌有多个。(2)(2)噬菌体的衍生物和某些病毒的噬菌体的衍生物和某些病毒的DNADNA。一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需求，对某些天然的载体进行人工改造。们根据不同的目的和需求，对某些天然的载体进行人工改造。 最常用的载体是质粒，它来源于细菌和酵最常用的载体是质粒，它来源于细菌和酵母菌等生物，其上的基因属于细胞质基因。它能自我复制，母菌等生物，其上的基因属于细胞质基因。它能自我复制，既可在自身细胞、受体细胞复制，也可在体外复制。既可在自身细胞、受体细胞复制，也可在体外复制。主动运输中载体蛋白的化学本质是蛋白质，其作用是运输主动运输中载体蛋白的化学本质是蛋白质，其作用是运输离子、氨基酸、核苷酸等物质进出细胞。而基因工程中的载离子、氨基酸、核苷酸等物质进出细胞。而基因工程中的载体的化学本质是体的化学本质是DNADNA，其作用是携带目的基因进入受体细胞。，其作用是携带目的基因进入受体细胞。【典例典例3 3】(2010(2010江苏高考改造江苏高考改造) )下表中列出了几种限制酶下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图识别序列及其切割位点，图1 1、图、图2 2中箭头表示相关限制酶的中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：酶切位点。请回答下列问题：(1)(1)一个图一个图1 1所示的质粒分子经所示的质粒分子经SmaSma切割前后，分别含有切割前后，分别含有_个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。(2)(2)若对图中质粒进行改造，插入的若对图中质粒进行改造，插入的SmaSma酶切位点越多，质酶切位点越多，质粒的热稳定性越粒的热稳定性越_。(3)(3)用图中的质粒和外源用图中的质粒和外源DNADNA构建重组质粒，不能使用构建重组质粒，不能使用SmaSma切割，原因是切割，原因是_。(4)(4)与只使用与只使用EcoREcoR相比较，使用相比较，使用BamHBamH和和Hind Hind 两种限制两种限制酶同时处理质粒、外源酶同时处理质粒、外源DNADNA的优点在于可以防止的优点在于可以防止_。(5)(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入合，并加入_酶。酶。(6)(6)现使用现使用BamHBamH和和HindHind两种限制酶同时处理质粒、外源两种限制酶同时处理质粒、外源DNADNA，并经拼接获得的重组质粒进行再次酶切，假设所用的，并经拼接获得的重组质粒进行再次酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图酶均可将识别位点完全切开，请根据图1 1、2 2中标示的酶切位中标示的酶切位点及表所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。点及表所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。采用采用BamHBamH和和HindHind酶切，得到酶切，得到_种种DNADNA片段。片段。采用采用EcoREcoR和和HindHind酶切，得到酶切，得到_种种DNADNA片段。片段。 【解题关键解题关键】仔细辨析不同限制酶的识别序列，并分仔细辨析不同限制酶的识别序列，并分析这些序列在质粒和外源析这些序列在质粒和外源DNADNA上的位置，分析切割可能带来上的位置，分析切割可能带来的各种因素。对重组质粒进行再切时，一定要分析原有限制的各种因素。对重组质粒进行再切时，一定要分析原有限制酶识别序列有未被破坏。酶识别序列有未被破坏。【标准解答标准解答】(1)(1)该质粒为环状该质粒为环状DNADNA，经，经SmaSma切割前，不含切割前，不含有游离的磷酸基团，经有游离的磷酸基团，经SmaSma切割后形成平末端，含有切割后形成平末端，含有2 2个游个游离的磷酸基团。离的磷酸基团。(2)Sma(2)Sma识别的是识别的是CCCGGGCCCGGG序列，在序列，在C C与与G G之间切割，之间切割，SmaSma酶酶切位点越多，也就是切位点越多，也就是C-GC-G碱基对越多，碱基对越多，C C与与G G之间的氢键之间的氢键(3(3个个) )比比A A与与T T之间的氢键之间的氢键(2(2个个) )数量多，其含量越多，质粒的热稳数量多，其含量越多，质粒的热稳定性越高。定性越高。(3)(3)据图据图1 1可知，可知，SmaSma切割位点在抗生素抗性基因切割位点在抗生素抗性基因( (标记基因标记基因) )中，据图中，据图2 2可知，可知，SmaSma切割位点在目的基因中，因此使用切割位点在目的基因中，因此使用SmaSma切割会破坏质粒的抗性基因、外源切割会破坏质粒的抗性基因、外源DNADNA中的目的基因。中的目的基因。(4)(4)用同一种限制酶处理质粒和外源用同一种限制酶处理质粒和外源DNADNA，再用，再用DNADNA连接酶连连接酶连接时，往往会有三种连接形式：目的基因接时，往往会有三种连接形式：目的基因- -质粒、目的基因质粒、目的基因- -目的基因目的基因( (环化环化) )、质粒、质粒- -质粒质粒( (环化环化) )，后两种是我们不需要，后两种是我们不需要的，因而要进行筛选。用两种限制酶处理质粒和外源的，因而要进行筛选。用两种限制酶处理质粒和外源DNADNA，因形成的末端不同可避免上述情况的发生。因形成的末端不同可避免上述情况的发生。(5)(5)连接质粒与目的基因的工具酶是连接质粒与目的基因的工具酶是DNADNA连接酶。连接酶。(6)(6)分析由分析由BamHBamH和和HindHind两种限制酶同时处理质粒、外源两种限制酶同时处理质粒、外源DNADNA，并经拼接获得的重组质粒，这两种酶的识别序列仍然，并经拼接获得的重组质粒，这两种酶的识别序列仍然完整存在，如再用完整存在，如再用BamHBamH和和HindHind两种限制酶进行酶切时，两种限制酶进行酶切时，可再度被切开，形成可再度被切开，形成2 2种种DNADNA片段；而片段；而EcoREcoR的识别序列在原的识别序列在原质粒中存在并没有破坏，同时切下的目的基因中还存在质粒中存在并没有破坏，同时切下的目的基因中还存在1 1个个EcoREcoR的识别序列，因此在重组质粒中存在的识别序列，因此在重组质粒中存在2 2个个EcoREcoR的识的识别序列，如用别序列，如用EcoREcoR和和HindHind酶切，可得到酶切，可得到3 3种种DNADNA片段。片段。答案答案: :(1)0(1)0、2 (2)2 (2)高高 (3)Sma(3)Sma会破坏质粒的抗性基因和会破坏质粒的抗性基因和外源外源DNADNA中的目的基因中的目的基因(4)(4)质粒和含目的基因的外源质粒和含目的基因的外源DNADNA片段自身环化片段自身环化(5)DNA(5)DNA连接连接 (6)2 3(6)2 31.1.能有效地打破物种的界限，定向地改造生物的遗传性状，能有效地打破物种的界限，定向地改造生物的遗传性状，培育新的农作物优良品种的生物技术是培育新的农作物优良品种的生物技术是( )( )A.A.基因工程技术基因工程技术 B.B.诱变育种技术诱变育种技术C.C.杂交育种技术杂交育种技术 D.D.组织培养技术组织培养技术【解析解析】选选A A。基因工程的优点是能定向地改造生物的遗传。基因工程的优点是能定向地改造生物的遗传性状，并能克服远缘杂交不亲和的障碍，只有性状，并能克服远缘杂交不亲和的障碍，只有A A项符合。项符合。 2.(20102.(2010安庆四校联考安庆四校联考) )下表关于基因工程中有关基因操作下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是的名词及对应的内容，正确的组合是( )( )【解析解析】选选C C。供体指的是提供目的基因的个体，受体是指。供体指的是提供目的基因的个体，受体是指接受目的基因的个体，基因的手术刀是限制性核酸内切酶，接受目的基因的个体，基因的手术刀是限制性核酸内切酶，基因的缝合针是基因的缝合针是DNADNA连接酶，载体常用的是质粒，也常用动连接酶，载体常用的是质粒，也常用动植物病毒。植物病毒。3.3.下列关于染色体和质粒的叙述，正确的是下列关于染色体和质粒的叙述，正确的是( )( )A.A.染色体和质粒的化学本质都是染色体和质粒的化学本质都是DNADNAB.B.染色体和质粒都只存在于真核细胞中染色体和质粒都只存在于真核细胞中C.C.染色体和质粒都与生物的遗传有关染色体和质粒都与生物的遗传有关D.D.染色体和质粒都可以作为基因工程的载体染色体和质粒都可以作为基因工程的载体【解析解析】选选C C。染色体是由。染色体是由DNADNA和蛋白质构成的，染色体存在和蛋白质构成的，染色体存在于真核细胞中，质粒主要存在于原核细胞中，于真核细胞中，质粒主要存在于原核细胞中，DNADNA是原核生是原核生物和真核生物的遗传物质，质粒控制原核生物的部分性状。物和真核生物的遗传物质，质粒控制原核生物的部分性状。4.4.水母发光蛋白由水母发光蛋白由236236个氨基酸构成，其中由三种氨基酸构个氨基酸构成，其中由三种氨基酸构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记。成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记。在转基因技术中，这种蛋白质的作用是在转基因技术中，这种蛋白质的作用是( )( )A.A.促使目的基因导入受体细胞中促使目的基因导入受体细胞中B.B.促使目的基因在受体细胞中复制促使目的基因在受体细胞中复制C.C.促使目的基因容易被检测出来促使目的基因容易被检测出来D.D.促使目的基因容易成功表达促使目的基因容易成功表达【解析解析】选选C C。该发光蛋白基因属于标记基因，可用于重组。该发光蛋白基因属于标记基因，可用于重组DNADNA的鉴定与检测，使目的基因容易被检测出来。的鉴定与检测，使目的基因容易被检测出来。 5.5.下列哪项叙述不是载体必须具备的条件下列哪项叙述不是载体必须具备的条件( )( )A.A.具有某些标记基因具有某些标记基因 B.B.决定受体细胞的生存决定受体细胞的生存C.C.能够在受体细胞中复制能够在受体细胞中复制 D.D.有多个限制酶切割位点有多个限制酶切割位点【解析解析】选选B B。载体的条件是必须对受体细胞无毒无害，不。载体的条件是必须对受体细胞无毒无害，不能决定受体细胞的生存，所以能决定受体细胞的生存，所以B B项是不正确的。项是不正确的。A A、C C、D D三项三项是基本概念的考查。是基本概念的考查。 6.6.科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒粒DNADNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。图示分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。图示a a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNADNA结合的位置，它们彼此结合的位置，它们彼此能结合的依据是能结合的依据是( )( )A.A.基因自由组合定律基因自由组合定律 B.B.半保留复制原则半保留复制原则C.C.基因分离定律基因分离定律 D.D.碱基互补配对原则碱基互补配对原则【解析解析】选选D D。本题考查基因工程的相关知识。重组质粒依。本题考查基因工程的相关知识。重组质粒依据的是黏性末端的碱基互补配对原则。据的是黏性末端的碱基互补配对原则。7.7.一环状一环状DNADNA分子，设其长度为分子，设其长度为1 1。限制性内切酶。限制性内切酶A A在其上的在其上的切点位于切点位于0.00.0处；限制性内切酶处；限制性内切酶B B在其上的切点位于在其上的切点位于0.30.3处；处；限制性内切酶限制性内切酶C C的切点未知。但的切点未知。但C C单独切或与单独切或与A A或或B B同时切的结同时切的结果如下表，请确定果如下表，请确定C C在该环形在该环形DNADNA分子的切点应位于图中的分子的切点应位于图中的 ( )( )A.0.2A.0.2和和0.40.4处处 B.0.4B.0.4和和0.60.6处处C.0.5C.0.5和和0.70.7处处 D.0.6D.0.6和和0.90.9处处【解析解析】选选A A。从。从C C与与A A同时切，存在长度为同时切，存在长度为2 2个个0.20.2的片段，的片段，说明说明C C切点在切点在A A切点两侧，从切点两侧，从C C与与B B同时切，存在长度为同时切，存在长度为2 2个个0.10.1的片段，说明的片段，说明C C切点在切点在B B切点两侧，再分析两次切割的其他片切点两侧，再分析两次切割的其他片段，可发现段，可发现A A项是正确的。项是正确的。8.(20118.(2011启东高二检测启东高二检测) )如图为大肠杆菌及质粒载体的结构如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。模式图，据图回答下列问题。(1)a(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是代表的物质和质粒的化学本质都是_，二者还具有其他共同点，如二者还具有其他共同点，如_，_(_(写出两条即写出两条即可可) )。(2)(2)若质粒若质粒DNADNA分子的切割末端为分子的切割末端为 ，则与之连接的，则与之连接的目的基因切割末端应为目的基因切割末端应为_；可使用；可使用_把质粒和目的基把质粒和目的基因连接在一起。因连接在一起。(3)(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒氨苄青霉素抗性基因在质粒DNADNA上称为上称为_，其作用是，其作用是_。(4)(4)下列常在基因工程中用作载体的是下列常在基因工程中用作载体的是( )( )A.A.苏云金芽孢杆菌抗虫基因苏云金芽孢杆菌抗虫基因B.B.土壤农杆菌中的土壤农杆菌中的RNARNA分子分子C.C.大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒D.D.动物细胞的染色体动物细胞的染色体【解析解析】本题通过质粒结构的模式图考查质粒的功能和特点，本题通过质粒结构的模式图考查质粒的功能和特点，分析如下：分析如下：大肠杆菌的质粒是基因工程中最常用的载体，载体的本质为大肠杆菌的质粒是基因工程中最常用的载体，载体的本质为DNADNA，抗虫基因属于目的基因，不属于载体，染色体的主要，抗虫基因属于目的基因，不属于载体，染色体的主要成分为成分为DNADNA和蛋白质，不属于载体。和蛋白质，不属于载体。答案：答案：(1)DNA (1)DNA 能够自我复制能够自我复制 具有遗传效应具有遗传效应(2) DNA(2) DNA连接酶连接酶(3)(3)标记基因标记基因 供重组供重组DNADNA的鉴定和选择的鉴定和选择 (4)C(4)C9.9.通过通过DNADNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，如图表示这动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，如图表示这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“剪刀剪刀”能识别能识别的序列和切点是的序列和切点是-G-GGATCC-GATCC-，请回答：，请回答： (1)(1)从羊染色体中从羊染色体中“剪下剪下”羊蛋白质基因的酶是羊蛋白质基因的酶是_。人体。人体蛋白质基因蛋白质基因“插入插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是是_。(2)(2)请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。(3)(3)人体蛋白质基因之所以能人体蛋白质基因之所以能“插入插入”到羊的染色体内，原到羊的染色体内，原因是因是_，“插入插入”时用的工具是时用的工具是_，其种类有，其种类有_。【解析解析】本题主要考查各种工具在基因工程中的作用，要明本题主要考查各种工具在基因工程中的作用，要明确限制酶的作用是切取目的基因，确限制酶的作用是切取目的基因，DNADNA连接酶起连接酶起“缝合缝合”作作用，载体能把目的基因导入受体细胞。用，载体能把目的基因导入受体细胞。(1)(1)“剪刀剪刀”为限制为限制酶，剪下羊蛋白质基因，使用酶，剪下羊蛋白质基因，使用DNADNA连接酶将其与载体结合。连接酶将其与载体结合。(2)(2)由图示可知限制酶识别的序列为由图示可知限制酶识别的序列为-GGATCC-GGATCC-，并且在，并且在G G与与G G之间切开，形成的黏性末端为反向重复的，所以两个末端之间切开，形成的黏性末端为反向重复的，所以两个末端分别为分别为 与与 。 (3)(3)插入时目的基因与原有基因结合，都为反向平行的双插入时目的基因与原有基因结合，都为反向平行的双螺旋结构，插入时需要载体。螺旋结构，插入时需要载体。答案：答案：(1)(1)限制酶限制酶 DNADNA连接酶连接酶(2)(2)(3)(3)基因的结构是相同的基因的结构是相同的 载体载体质粒、动植物病毒及质粒、动植物病毒及噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物10.10.质粒是基因工程中最常用的载体，它质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内，某细菌质粒上的标存在于许多细菌体内，某细菌质粒上的标记基因如图所示，通过标记基因可以推知记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因外源基因( (目的基因目的基因) )是否转移成功。外源是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示，外源基因在质粒中可插入的位生长情况也不同，如图所示，外源基因在质粒中可插入的位置有置有a a、b b、c c点。某同学根据实验现象对其插入的位点进行点。某同学根据实验现象对其插入的位点进行分析，其中分析正确的是分析，其中分析正确的是( )( )【解析解析】选选B B。若质粒插入。若质粒插入a a或或b b点，则会破坏抗四环素基因点，则会破坏抗四环素基因或抗青霉素基因，则在含有四环素或青霉素的培养基上不能或抗青霉素基因，则在含有四环素或青霉素的培养基上不能生长，因此生长，因此A A项不正确，项不正确，B B项正确。若质粒插入项正确。若质粒插入c c点，两种基点，两种基因保持完整，在分别含有每种抗生素的培养基上都能生长，因保持完整，在分别含有每种抗生素的培养基上都能生长，C C项和项和D D项均不正确。项均不正确。11.(201111.(2011济南高二检测济南高二检测) )某线性某线性DNADNA分子含有分子含有3 0003 000个碱基个碱基对对(bp)(bp)，先用限制酶，先用限制酶a a切割，再把得到的产物用限制酶切割，再把得到的产物用限制酶b b切割，切割，得到的得到的DNADNA片段大小如下表。限制酶片段大小如下表。限制酶a a和和b b的识别序列和切割的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是位点如图所示。下列有关说法正确的是( (多选多选)( )( )A.A.在该在该DNADNA分子中，分子中，a a酶与酶与b b酶的识别序列分别有酶的识别序列分别有3 3个和个和2 2个个B.aB.a酶与酶与b b酶切出的黏性末端不能相互连接酶切出的黏性末端不能相互连接C.aC.a酶与酶与b b酶切断的化学键相同酶切断的化学键相同D.D.用这两种酶和用这两种酶和DNADNA连接酶对该连接酶对该DNADNA分子进行反复切割、连接分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，操作，若干循环后， 序列会明显增多序列会明显增多【解析解析】选选C C、D D。限制酶。限制酶a a切割为切割为3 3段，有两个切割位点，其段，有两个切割位点，其产物又被限制酶产物又被限制酶b b切割，形成两种产物，即再被切割两次，切割，形成两种产物，即再被切割两次，有二个切割位点，有二个切割位点，A A项不正确。项不正确。B B项中项中a a酶与酶与b b酶切出的黏性末酶切出的黏性末端能相互连接，端能相互连接，B B项不正确。项不正确。C C项中两种限制酶切断的化学键项中两种限制酶切断的化学键都是磷酸二酯键。都是磷酸二酯键。D D项经分析项经分析a a酶与酶与b b酶的识别序列及切割位酶的识别序列及切割位点，不难发现它们形成的黏性末端可以相互配对连接，但一点，不难发现它们形成的黏性末端可以相互配对连接，但一旦连接后，形成的重组旦连接后，形成的重组DNADNA中已不存在原来两种限制酶的识中已不存在原来两种限制酶的识别序列，不能再被切割，可以保存下来，因此经过若干次循别序列，不能再被切割，可以保存下来，因此经过若干次循环操作后：环操作后： 和和 序列会明显增序列会明显增多，即多，即D D项是正确的。项是正确的。 【方法技巧方法技巧】“限制酶识别序列限制酶识别序列”的辨析方法的辨析方法(1)(1)不同限制酶识别序列的辨析：首先要认真分析不同限制不同限制酶识别序列的辨析：首先要认真分析不同限制酶特定的识别序列，寻找它们的共同点，再分析目的基因或酶特定的识别序列，寻找它们的共同点，再分析目的基因或质粒切割位点的个数和部位，可以简单地画些草图进行直观质粒切割位点的个数和部位，可以简单地画些草图进行直观的分析，同时结合相应的碱基对比例、切割后的游离磷酸基的分析，同时结合相应的碱基对比例、切割后的游离磷酸基团等知识进行解题。团等知识进行解题。(2)(2)不同识别序列的限制酶同时处理质粒、目的基因并进行不同识别序列的限制酶同时处理质粒、目的基因并进行拼接时，首先要分析这种操作的优点：可以提高质粒与目的拼接时，首先要分析这种操作的优点：可以提高质粒与目的基因定向连接效率；其次要分析能进行拼接的前提：只有相基因定向连接效率；其次要分析能进行拼接的前提：只有相同黏性末端才能进行拼接；最后还要分析拼接保留或破坏了同黏性末端才能进行拼接；最后还要分析拼接保留或破坏了哪些限制酶的识别序列。哪些限制酶的识别序列。(3)(3)形成重组质粒后，用不同限制酶进行再次切割，可形成形成重组质粒后，用不同限制酶进行再次切割，可形成的片段分析：解决这类问题一定要分析经的片段分析：解决这类问题一定要分析经DNADNA连接酶形成的连接酶形成的重组质粒中原限制酶的识别序列有没有发生改变重组质粒中原限制酶的识别序列有没有发生改变( (即是否存即是否存在在) )。如不存在，则不能被该限制酶再次切割，不能形成原。如不存在，则不能被该限制酶再次切割，不能形成原来的黏性末端。来的黏性末端。12.12.为了解基因结构，通常选取一特定长度的线性为了解基因结构，通常选取一特定长度的线性DNADNA分子，分子，先用一种限制酶切割，通过电泳技术将单酶水解片段分离，先用一种限制酶切割，通过电泳技术将单酶水解片段分离，计算相对大小；然后再用另一种酶对单酶水解片段进行降解，计算相对大小；然后再用另一种酶对单酶水解片段进行降解，分析片段大小。下表是某小组进行的相关实验。分析片段大小。下表是某小组进行的相关实验。(1)(1)该实验设计主要体现了该实验设计主要体现了_原则。原则。(2)(2)由实验可知，在这段已知序列上，由实验可知，在这段已知序列上，A A酶与酶与B B酶的识别序列酶的识别序列分别为分别为_个和个和_个。个。(3)(3)根据表中数据，请在下图中标出相应限制酶的酶切位点根据表中数据，请在下图中标出相应限制酶的酶切位点并注明相关片段的大小。并注明相关片段的大小。【解析解析】(1)(1)分析表格中实验设计过程，发现实验设计体现了分析表格中实验设计过程，发现实验设计体现了单一变量的原则单一变量的原则( (对照原则对照原则) )。(2)(2)经经A A酶切割，可形成酶切割，可形成4 4个片段个片段(2 100(2 100、1 4001 400、1 0001 000、500 bp)500 bp)，即，即A A酶的识别序列有酶的识别序列有3 3个；经个；经B B酶切割，可形成酶切割，可形成3 3个片个片段段(2 500(2 500、1 3001 300、1 200 bp)1 200 bp)，即，即B B酶的识别序列有酶的识别序列有2 2个。个。(3)(3)经经A A、B B酶同时切割，可形成酶同时切割，可形成6 6个片段，即有个片段，即有5 5个识别序列，个识别序列，又结合计算推导，可得出：又结合计算推导，可得出： 答案：答案：(1)(1)对照对照( (单一变量单一变量) )(2)3 2(2)3 2(3)(3)小小 结结检测与鉴定检测与鉴定