植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测植物基因组DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测n脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(RNA)(RNA) n与蛋白质结合在一起以核蛋白（与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNPDNP）的形式存在。）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。释放出来。n植物总植物总DNADNA包括细胞核包括细胞核DNADNA和细胞核外和细胞核外DNA,DNA,前者存在前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNADNA(mtDNA) )和叶绿体和叶绿体DNA(ctDNADNA(ctDNA) )。背景知识背景知识核酸的存在形式核酸的存在形式nDNADNA为白色类似石棉样的为白色类似石棉样的纤维状物纤维状物，RNARNA的纯品呈的纯品呈白色粉末或结晶白色粉末或结晶。nDNADNA、RNARNA和核苷酸都是和核苷酸都是极性化合物极性化合物，一般都溶于，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。游离酸易溶于水。n在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。中较稳定。 核酸的理化性质核酸的理化性质细胞破碎细胞破碎 抽提去蛋白质抽提去蛋白质 沉淀核酸沉淀核酸基本过程基本过程 机械方法：机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法；超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：化学试剂法：用用SDSSDS处理细胞；处理细胞； 酶解法：酶解法： 加入溶菌酶，破坏细胞壁。加入溶菌酶，破坏细胞壁。 细胞破碎细胞破碎 uSDSSDS法法 SDSSDS是是有有效效的的阴阴离离子子去去垢垢剂剂, , 细细胞胞中中DNADNA与与蛋蛋白白质质之之间间常常借借静静电电引引力力或或配配位位键键结结合合, , SDSSDS能能够够破破坏坏这种价键。这种价键。uCTABCTAB法法 CTABCTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的脂膜，使细胞中的DNA-DNA-蛋白质复合物释放出来，并蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使使蛋白质变性，使DNADNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。DNADNA提取提取u蛋白质蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（常用苯酚：氯仿：异戊醇（2525：2424：1 1）或氯仿：异戊醇（或氯仿：异戊醇（2424：1 1）抽提。）抽提。uRNA RNA 常选用常选用RNaseRNase消化消化 ，或是用，或是用LiClLiCl来消除大分来消除大分子的子的RNARNA。u酚类物质酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。的材料。u多糖多糖 提取液中加提取液中加1 1PVPPVP。DNADNA纯化（去杂质）纯化（去杂质）实验材料实验材料 新鲜蔬菜叶片新鲜蔬菜叶片( (去叶脉去叶脉) )试剂试剂 2CTAB2CTAB抽提液抽提液 TE TE 缓冲液缓冲液(pH=8.0) (pH=8.0) 氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇(24:1)(24:1) 材料与试剂材料与试剂离心机离心机 水浴锅水浴锅研钵研钵 微量移液器微量移液器仪器用具仪器用具移液器量程的选择移液器量程的选择1取取 2g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加 1/3 药匙石英砂药匙石英砂和和 4mL 2 倍的倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。提取液，迅速研磨。2将将 1mL 研磨液转入研磨液转入 1.5mL 离心管中，置于离心管中，置于65水浴中保水浴中保温温 20min，其间颠倒混匀，其间颠倒混匀23次。次。破碎细胞破碎细胞3. 12000r/min 离心离心 5min，取上清液，取上清液700L转到另一离心管转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒）混合液，充分颠倒混匀。混匀。12000r/min，离心，离心 5min。抽提去蛋白抽提去蛋白4将上清液移入新的离心管内，加将上清液移入新的离心管内，加 600L异丙醇。颠倒混匀，异丙醇。颠倒混匀，可见可见 DNA 絮状沉淀。絮状沉淀。沉淀核酸沉淀核酸512000r/min，离心，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。燥。 将沉淀回溶于将沉淀回溶于20L TE 缓冲液待测。缓冲液待测。操作步骤操作步骤1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提抽提液充分混匀；液充分混匀；2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（加巯基乙醇（25），尽可能选取幼嫩的材料；），尽可能选取幼嫩的材料；3）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。时还要避免核酸降解酶类的降解。注意事项注意事项DNADNA分子在高于等电分子在高于等电点的点的PHPH溶液中带负溶液中带负电荷，在电场中向电荷，在电场中向正极移动。在一定正极移动。在一定电场强度下，电场强度下，DNADNA分分子的迁移速度与相子的迁移速度与相对分子质量的对数对分子质量的对数成反比。成反比。电泳原理电泳原理琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)线型线型线型线型DNADNA分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围(Kb)(Kb)0.30.35 560600.60.61 120200.70.70.80.810100.90.90.50.57 71.21.20.90.96 61.51.50.20.23 312.012.00.10.12 2仪器和试剂仪器和试剂仪器仪器电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽灌胶模具等灌胶模具等Tris-硼酸（硼酸（TBE） Tris-乙酸（乙酸（TAE） Tris-磷酸（磷酸（TPE）常用电泳缓冲液常用电泳缓冲液 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖与蔗糖、甘油或聚蔗糖400400组成上样缓冲液。组成上样缓冲液。 作用：作用：增加样品比重，以确保增加样品比重，以确保DNADNA均匀沉入加样孔内。均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液上样缓冲液溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）是一种荧光染料，是一种荧光染料，EBEB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNADNA的含的含量成正比。据此可粗略估计样品量成正比。据此可粗略估计样品DNADNA浓度。浓度。 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶EBEB染色，肉眼可见核酸电泳带，其染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNADNA量一般量一般5ng5ng。核酸染色剂核酸染色剂注意事项：注意事项：EBEB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。DNADNA分子量标准分子量标准不不同同种种类类DNA Marker1.1.凝胶制备凝胶制备 制备制备0.8%0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入入 20mL 0.5TBE20mL 0.5TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60 50-60 时，加入时，加入 EB EB 至终浓度至终浓度 g/mLg/mL。缓慢倒入胶。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。板，待胶凝固后拔出梳子。2.2.加样加样 取取1010l DNAl DNA样液与样液与 2 2l l 上样上样 buffer buffer 混匀，混匀，用微量移液器小心加入样品槽。用微量移液器小心加入样品槽。3.3.电泳电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为为15V/cm15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）（长度以两个电极之间的距离计算）, ,待溴酚待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。兰移动到一定位置，停止电泳。4.4.观察拍照观察拍照四、操作步骤四、操作步骤1.1.结结合合原原理理，简简述述CTABCTAB法法分分离离提提取植物总取植物总DNADNA的基本过程。的基本过程。2.2.为为了了获获得得高高质质量量的的植植物物总总DNADNA，在在分分离离提提取取过过程程中中应应注注意意那那些问题？些问题？What?!How?!思考思考