血清谷丙转氨酶活性的测定血清谷丙转氨酶活性的测定一、实验目的一、实验目的一、实验目的一、实验目的1. 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。2. 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。3. 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。二、基本原理二、基本原理 血清中的谷血清中的谷-丙转氨酶（丙转氨酶（ALT），在），在37、的条件下，、的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与可催化基质（底物）液中的丙氨酸与-酮戊二酸反应酮戊二酸反应生成谷氨酸和丙酮酸：生成谷氨酸和丙酮酸： 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系活性的高低成正比关系。据此与同样处。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中中ALT的活性。的活性。* 仪器1. 515cm试管、刻度吸量管。2. 恒温水浴、离心机、721型分光光度计。* 试剂磷酸盐缓冲液磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO4或Na2HPO42H2溶 解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml,4保存。磷酸二氢钾溶液：称KH2PO4溶解dH2O中，稀释至1000ml, 4保存。将磷酸氢二钠溶液420ml和磷酸二氢钾溶液80ml混和即 为的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4保存。三、仪器与试剂三、仪器与试剂 2. 标准丙酮酸（含丙酮酸）标准丙酮酸（含丙酮酸） 取标准丙酮酸钠取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为，用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当。此液须当日用当日配。日配。3. ALT底物液底物液(含含-酮戊二酸酮戊二酸2mol/ml及及DL-丙氨酸丙氨酸200mol/ml) 取取-酮戊酮戊二酸，二酸，DL-丙氨酸丙氨酸7g ,用试剂用试剂1溶成溶成100ml，在稀释到刻度前，以，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调调pH至（因为转氨酶在以下或以上的环境中酶活性下降），加数滴至（因为转氨酶在以下或以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。天。二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液 取分析纯取分析纯2,4二硝基苯肼，用二硝基苯肼，用1mol /L HCl溶于溶于100ml，置棕色瓶中保存。，置棕色瓶中保存。NaOH溶液溶液 常规配制。常规配制。1、血清样品制备、血清样品制备 取鸡血取鸡血100mL于于4oC静置静置10hr，后经离心分离得到血清，后经离心分离得到血清， 保存于冰箱中待用保存于冰箱中待用(由于血细胞中转氨酶活性较血清中由于血细胞中转氨酶活性较血清中 高，故应防止溶血；若血清中此酶活性过高，则可适高，故应防止溶血；若血清中此酶活性过高，则可适 当稀释后再用当稀释后再用) 。2、标准曲线制作、标准曲线制作 取取6 6支干燥洁净的试管，按下表操作，得出实验结果。支干燥洁净的试管，按下表操作，得出实验结果。 以吸光度值为纵坐标，酶活力单位数为横坐标，在坐标以吸光度值为纵坐标，酶活力单位数为横坐标，在坐标 纸上绘制标准曲线。纸上绘制标准曲线。四、实验操作四、实验操作 3、血清样品谷丙转氨酶活性的测定、血清样品谷丙转氨酶活性的测定 取取4 4支干燥洁净试管，按下表操作（血清和底物溶液支干燥洁净试管，按下表操作（血清和底物溶液 事先保温事先保温10min10min）：）：五、实验结果五、实验结果 1、将得出的吸光值在标准曲线上查得酶活性、将得出的吸光值在标准曲线上查得酶活性2、计算：、计算： 丙酮酸物质的量（丙酮酸物质的量（mol） SGPT活性单位活性单位/100mL= 1000 时间（时间（min）1. 1. 在测定在测定SGPTSGPT时，应事先将底物、血清在时，应事先将底物、血清在3737水浴中水浴中 保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2. 2. 标准曲线上数值在标准曲线上数值在20500U20500U是准确可靠的，超过是准确可靠的，超过 500U500U时，需将样品稀释。时，需将样品稀释。3. 3. 转氨酶只能作用于转氨酶只能作用于L L氨基酸，对氨基酸，对D D氨基酸无氨基酸无 作用。实验室多用作用。实验室多用DLDL氨基酸（较氨基酸（较L L氨基酸氨基酸 价廉），若用价廉），若用L L氨基酸，则用量减半。氨基酸，则用量减半。4. 4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高， 会影响测定效果。会影响测定效果。5. 5. 血清样品的测定需在显色后血清样品的测定需在显色后3030分钟内完成。分钟内完成。六、注意事项六、注意事项 6.丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓后易变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。度而不易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。7.每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过，若有超每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过，若有超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本标本可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管对照管9. 9. 操作中加操作中加 0.4N NaOH0.4N NaOH液时，需以较慢速度加入，液时，需以较慢速度加入，并且边加边摇匀加快时则并且边加边摇匀加快时则a a一戊酮二酸引起的发色一戊酮二酸引起的发色增强。增强。10. 10. 本实验中各试剂加量都需要准确，并且要注本实验中各试剂加量都需要准确，并且要注意控制条件，保温时间要严格意控制条件，保温时间要严格. .11.11.本法测定本法测定SGTPSGTP正常值为正常值为4040单位以下。单位以下。* 1个卡门氏单位的定义是：在温度个卡门氏单位的定义是：在温度25，波长，波长340nm，光径，光径1cm 的条件下，的条件下，1ml血清使血清使NADH的吸光度下降的转氨酶活性。的吸光度下降的转氨酶活性。* * 国际单位：在最适温度（国际单位：在最适温度（2525）下，）下，1 1分钟产生分钟产生1 1mol丙酮酸的酶量为丙酮酸的酶量为1个活性单位，即个活性单位，即1IU=1umol/min。* King法单位定义是：每法单位定义是：每1ml血清在血清在37条件下与底物作用条件下与底物作用60 min，生，生 成成1mol丙酮酸称为一个单位。丙酮酸称为一个单位。 * Mohun 法单位定义是：每毫升血清在，法单位定义是：每毫升血清在，37条件下与底物作用条件下与底物作用 30 min，每生成微克丙酮酸为，每生成微克丙酮酸为1单位。单位。七、酶活性单位的定义七、酶活性单位的定义 六、临床意义六、临床意义 化验介绍化验介绍: : 正常时，谷丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细胞含正常时，谷丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细胞含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放血中。所以量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放血中。所以血清中此酶活力很低。血清中此酶活力很低。当肝脏、心肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各种当肝脏、心肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各种酶释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清中此酶酶释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清中此酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的依据。的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的依据。 临床意义临床意义: : 谷丙转氨酶的增高意义较大，其增高程度可反谷丙转氨酶的增高意义较大，其增高程度可反映肝细胞损害和坏死的程度。映肝细胞损害和坏死的程度。（1 1）肝胆疾病：）肝胆疾病：急性病毒性肝炎，急性病毒性肝炎，ALTALT是最为敏感的指标之一，会出现明显是最为敏感的指标之一，会出现明显升高。慢性肝炎血清升高。慢性肝炎血清ALTALT升高一般不超过参考值的升高一般不超过参考值的3 3倍，而倍，而且有时可降至正常。慢性活动性肝炎血清且有时可降至正常。慢性活动性肝炎血清ALTALT可升高至参考可升高至参考值的值的3 35 5倍以上。活动型进行性肝硬化时倍以上。活动型进行性肝硬化时ALTALT可中轻度升高，可中轻度升高，但在代偿期可正常或稍增高。患原发性肝癌时，但在代偿期可正常或稍增高。患原发性肝癌时，ALTALT可正常可正常或中轻度升高。胆道疾病如胆石症引起梗阻时，虽无肝细或中轻度升高。胆道疾病如胆石症引起梗阻时，虽无肝细胞病变，但胞病变，但ALTALT可稍升高。可稍升高。 （2 2）其他疾病：）其他疾病：心肌梗塞及心功能不全导致肝淤血可使心肌梗塞及心功能不全导致肝淤血可使ALTALT明显升高。骨骼明显升高。骨骼疾病、多发性肌炎、肌营养不良均可使疾病、多发性肌炎、肌营养不良均可使ALTALT活性升高。某些活性升高。某些药物或毒物如异菸肼、鲁米娜、四氯化碳等可引起药物或毒物如异菸肼、鲁米娜、四氯化碳等可引起ALTALT活性活性升高。升高。 参考值参考值: : 速率法：速率法：0 030IU/L 30IU/L 【思考题思考题】 1. 1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意 义？义？ 2.2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？ 为什么要避免溶血？为什么要避免溶血？3.3.分析实验误差产生的原因分析实验误差产生的原因分析实验误差产生的原因分析实验误差产生的原因