L/O/G/O细胞培养的基本方法细胞培养的基本方法细胞培养的基本概念细胞培养的基本概念2细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。也可以是细胞群。细胞培养的目的与用途细胞培养的目的与用途2一一、基础研究基础研究(1)药物作用机理药物作用机理(2)基因功能基因功能(3)疾病发生机理疾病发生机理二二、科学研究科学研究:(1)新药筛选新药筛选:如药效研究如药效研究,中药有效成分筛选等中药有效成分筛选等.(2)疫苗研究与开发疫苗研究与开发:如如肝炎疫苗肝炎疫苗,艾滋病疫苗艾滋病疫苗，肿瘤疫苗肿瘤疫苗等等.(3)基因工程药物基因工程药物与细胞工程药物的与细胞工程药物的研究与开发研究与开发(4)单克隆抗体制备单克隆抗体制备细胞培养主要的设施器材细胞培养主要的设施器材2设施：施：超超净台、恒温培养箱、台、恒温培养箱、倒置倒置显微微镜、液氮、液氮储存罐、存罐、冰柜、恒温冰柜、恒温水浴槽、水浴槽、离心机、离心机、压力力蒸汽消毒器蒸汽消毒器。器材器材：一、一、玻璃玻璃器材器材玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已已较少使用）。少使用）。二、塑料器材二、塑料器材多孔培养板（多孔培养板（6,12,24,48,96）、培养皿、培养瓶、离心管、）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。存管。三、橡皮器材三、橡皮器材橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的管的塞子塞子、盖子。、盖子。四、金属器材四、金属器材剪刀剪刀、镊子、子、手手术刀刀、解剖刀、血管、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科、眼科镊及各种型号及各种型号针头五、其他物品五、其他物品纱布、布、注射器注射器、针头、滤头细胞培养的条件细胞培养的条件（1）适宜的温度和）适宜的温度和PH37，pH7.27.4。（2）气体环境）气体环境95%空气空气+5%CO2;适宜的湿度（适宜的湿度（无菌水不能干掉无菌水不能干掉）。）。（CO2：细胞生长所必需的成分：细胞生长所必需的成分,pH值维持，最低不能低于值维持，最低不能低于1%。）。）（3）营养物质）营养物质N源、源、C源、无机盐、维生素、源、无机盐、维生素、H2O，细胞培养基中含有。，细胞培养基中含有。常用的细胞培养基：常用的细胞培养基：DMEM，RPMI-1640，BME，M199等。等。（4）无菌条件）无菌条件紫外消毒、空气过滤、无菌滤头，高压灭菌、严格操作。紫外消毒、空气过滤、无菌滤头，高压灭菌、严格操作。设施、器材、试剂实物图设施、器材、试剂实物图培养细胞的分类培养细胞的分类按照是否贴壁：按照是否贴壁：贴壁细胞：大多数属此类细胞，如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质贴壁细胞：大多数属此类细胞，如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞等。细胞等。悬浮细胞：主要为取自血、骨髓、脾的细胞，如白血病细胞。悬浮细胞：主要为取自血、骨髓、脾的细胞，如白血病细胞。按照传代次数：按照传代次数：原代细胞：即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。（也有人把传代原代细胞：即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。（也有人把传代10次之次之内的细胞统称为原代细胞。）内的细胞统称为原代细胞。）细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如HeLa细胞、细胞、CHO细胞等。细胞等。原代培养原代培养原理：原理：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。原代培养方法：消化培养法、组织块培养法。原代培养方法：消化培养法、组织块培养法。原代消化培养法原代消化培养法（1）处理组织：用）处理组织：用Hanks液漂洗组织液漂洗组织23次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中置于含有青链霉素的混合液中3060分钟。分钟。（2）剪切：将组织切成）剪切：将组织切成23毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。（3）消化：置于）消化：置于37温箱消化，每隔温箱消化，每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。组织的硬度而定。（4）分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，）分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（5001000转转/分）离心收集细胞，弃上清。分）离心收集细胞，弃上清。（5）加入适量培养基重悬细胞加入适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。，分装入培养瓶中，补足培养基。（6）培养：置于）培养：置于37，5%CO2温箱培养。温箱培养。原代组织块培养法原代组织块培养法 （1）剪切：用剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成1mm3小小块。块。（2）摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一为宜，每一25ml培养瓶底可摆布培养瓶底可摆布2030块。块。（3）轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞，轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞，置置36.5温箱培养温箱培养2小时左右（勿超过小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。小时），使小块微干涸。（4）培养：从微箱中取出培养瓶，培养：从微箱中取出培养瓶，46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。细胞的传代细胞的传代细胞传代的概念：细胞传代的概念：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将原有细胞分成几部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）发生中毒。此时就需要将原有细胞分成几部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养，这个过程就称为传代（内，再进行培养，这个过程就称为传代（passage）。）。传代方法：传代方法：悬浮细胞传代、贴壁细胞传代。悬浮细胞传代、贴壁细胞传代。细胞的传代细胞的传代悬浮细胞传代悬浮细胞传代：（：（1）收集细胞悬液；）收集细胞悬液；（2）离心（）离心（1000转转/分，分，2分钟）；分钟）；（3）弃上清；）弃上清；（4）加入新鲜培养基重悬细胞；）加入新鲜培养基重悬细胞；（5）按照适当比例接种到新的培养皿；）按照适当比例接种到新的培养皿；（6）补足培养基；）补足培养基；（7）放于温箱培养。）放于温箱培养。重悬分装放入温箱细胞的传代细胞的传代贴壁细胞的传代：贴壁细胞的传代：（1）吸去陈旧培养基，并用）吸去陈旧培养基，并用PBS清洗细胞表面；清洗细胞表面；（2）加入胰酶消化细胞；加入胰酶消化细胞；（3）加入新鲜培养基终止胰酶消化；）加入新鲜培养基终止胰酶消化；（4）将细胞吹打下来，收集，离心；）将细胞吹打下来，收集，离心；（5）弃上清；）弃上清；（6）加入新鲜培养基重悬细胞；）加入新鲜培养基重悬细胞；（7）按照适当比例接种到新的培养皿；）按照适当比例接种到新的培养皿；（8）补足培养基；）补足培养基；（9）放于温箱培养。）放于温箱培养。终止胰酶消化并吹打重悬分装放入温箱吸去旧培养基，PBS清洗加入胰酶消化细胞的换液细胞的换液悬浮细胞换液：收集细胞悬液、离心、弃上清、加入新鲜培养基重悬、补足培养基。悬浮细胞换液：收集细胞悬液、离心、弃上清、加入新鲜培养基重悬、补足培养基。或者直接从旧瓶吸取一定细胞悬液加入新瓶，补足新鲜培养基即可。或者直接从旧瓶吸取一定细胞悬液加入新瓶，补足新鲜培养基即可。贴壁细胞换液：弃去陈旧培养基、贴壁细胞换液：弃去陈旧培养基、PBS清洗细胞表面、加入新鲜培养基。清洗细胞表面、加入新鲜培养基。细胞的冻存细胞的冻存悬浮细胞的冻存：悬浮细胞的冻存：（1）配制冻存液（胎牛血清：二甲基亚砜）配制冻存液（胎牛血清：二甲基亚砜9:1），每个冻存管需要），每个冻存管需要冻存液冻存液1ml。（2）收集细胞悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻）收集细胞悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入存管中，并立刻放入冻存盒内，放入-80冰箱，第二日转存冰箱，第二日转存于液氮中。于液氮中。细胞的冻存细胞的冻存贴壁细胞的冻存：贴壁细胞的冻存：（1）配制冻存液。）配制冻存液。（2）弃去陈旧培养基，）弃去陈旧培养基，PBS清洗细胞表面，胰酶消化，终止消化，清洗细胞表面，胰酶消化，终止消化，吹打细胞，收集悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分吹打细胞，收集悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入-80冰箱，第二冰箱，第二日转存于液氮中。日转存于液氮中。吸去旧培养基，PBS清洗加入胰酶消化终止胰酶消化并吹打细胞冻存的注意事项：细胞冻存的注意事项：（1）冻存液要最先配置。 原因一：二甲基亚砜（DMSO）在加入血清时会产热损伤细胞。 原因二：如果先用血清重悬细胞，再加入DMSO，则局部DMSO浓度过高，会 对细胞造成严重损伤（DMSO在室温下对细胞有害），影响日后的复苏。（2）冻存时要求细胞状态良好，最好是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。（3）最大限度的减少DMSO在室温下和细胞接触的时间。（4）冻存时要缓慢降温（慢冻），用细胞冻存盒可以做到每分钟降低1，细胞冻 存盒应先放在4 预冷，以减少细胞和DMSO在室温接触的时间；如果没有冻 存盒，则采用程序降温法。（4冰箱40min， -20冰箱30-60min， 置于-80 过夜，次日转入液氮。）细胞的复苏细胞的复苏悬浮细胞和贴壁细胞的复苏方法一样，区别在于复苏后死细胞的清除方法。悬浮细胞和贴壁细胞的复苏方法一样，区别在于复苏后死细胞的清除方法。复苏流程：复苏流程：（1）取一支离心管，加入）取一支离心管，加入3ml的新鲜培养基备用。的新鲜培养基备用。（2）取出冻存的细胞，于）取出冻存的细胞，于37的温水中，的温水中，1min之内迅速融化。之内迅速融化。（3）迅速将解冻后的细胞加入预先准备好的离心管中，）迅速将解冻后的细胞加入预先准备好的离心管中，1000转转/分钟，离分钟，离心心1分钟。分钟。（4）弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞。）弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞。（5）接种到培养皿（瓶）内，补足培养基，放入温箱培养。）接种到培养皿（瓶）内，补足培养基，放入温箱培养。补足培养基放入温箱重悬3ml新鲜培养基备用1min之内解冻迅速倒入细胞的复苏细胞的复苏复苏后死细胞的清除方法：复苏后死细胞的清除方法：悬浮细胞：细胞复苏后，每悬浮细胞：细胞复苏后，每2天按照天按照2:1或或3:1的比例传代一次，大约的比例传代一次，大约1周后，细胞生长周后，细胞生长状态良好。状态良好。贴壁细胞：细胞复苏后贴壁细胞：细胞复苏后6h（此时已有细胞贴壁），吸去培养基（含有大量死细胞），（此时已有细胞贴壁），吸去培养基（含有大量死细胞），重新加入新鲜培养基。重新加入新鲜培养基。细胞复苏的注意事项细胞复苏的注意事项（1）细胞复苏原则：）细胞复苏原则：快速融化（快融）。快速融化（快融）。（2）尽量减少室温下）尽量减少室温下DMSO和细胞接触的时间。和细胞接触的时间。预先准备好离心管并加入新鲜培养液；预先准备好离心管并加入新鲜培养液；在在1分钟之内分钟之内将细胞融化；将细胞融化；立立刻将融化后的细胞倒入离心管中。刻将融化后的细胞倒入离心管中。（3）复苏时，离心时间不宜过长，）复苏时，离心时间不宜过长，1分钟即可，长时间离心会对细胞造成损伤，分钟即可，长时间离心会对细胞造成损伤，降低细胞存活率。降低细胞存活率。（4）死亡的细胞应尽快清除掉，否则会影响存活细胞的状态。）死亡的细胞应尽快清除掉，否则会影响存活细胞的状态。（5）如果复苏不成功，更可能是因为冻存或保存过程中出现问题。）如果复苏不成功，更可能是因为冻存或保存过程中出现问题。细胞污染时的处理细胞污染时的处理有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室彻底消毒操作室，复苏或重新购置细，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。（1）使用抗生素）使用抗生素污染后清除用药需采用大于常用量污染后清除用药需采用大于常用量510倍的冲洗法，于加药后作用倍的冲洗法，于加药后作用2448小时，小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。再换常规培养液。此法在污染早期有效。（2）加温处理）加温处理将污染的组织培养物放在将污染的组织培养物放在41培养培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时所以在处理前要进行预试验，摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。若先用药物处理后，再以间。若先用药物处理后，再以41加温处理效果更佳。加温处理效果更佳。其他注意事项其他注意事项（1）细胞房要定期擦拭：包括地面、桌面、超净台等，先用自来水擦拭）细胞房要定期擦拭：包括地面、桌面、超净台等，先用自来水擦拭，再用消毒，再用消毒液（液（3 的来苏尔或者新洁尔灭的来苏尔或者新洁尔灭）擦拭，之后打开紫外灯，照射）擦拭，之后打开紫外灯，照射2h。（2）细胞培养箱定期灭菌：将培养箱中的铁架取出，高压灭菌，箱内壁用）细胞培养箱定期灭菌：将培养箱中的铁架取出，高压灭菌，箱内壁用75%酒精酒精擦拭，再用消毒液擦拭，紫外照射过夜。擦拭，再用消毒液擦拭，紫外照射过夜。（3）及时更换）及时更换CO2罐和罐和HEPA过滤器，确保培养箱中有充足的无菌水。过滤器，确保培养箱中有充足的无菌水。（4）及时补充液氮，不可使细胞露出液氮表面。）及时补充液氮，不可使细胞露出液氮表面。（5）进入细胞房要更换无菌服，带好手套、口罩、鞋套等。）进入细胞房要更换无菌服，带好手套、口罩、鞋套等。L/O/G/OThank You!