病毒感染的实验诊断病毒感染的实验诊断王王 跃跃临床微免教研室临床微免教研室什么是病毒？什么是病毒？n病毒（病毒（virus）是一类体积微小、结构简单、）是一类体积微小、结构简单、有严格的细胞内寄生性的非细胞型微生物。有严格的细胞内寄生性的非细胞型微生物。n 特点：特点：体积微小，只能在电镜下观察，能通过滤菌器体积微小，只能在电镜下观察，能通过滤菌器无完整的细胞结构：蛋白质衣壳核酸核心无完整的细胞结构：蛋白质衣壳核酸核心只有一种类型核酸：只有一种类型核酸：RNA或或DNA有严格的细胞内寄生性，只能在活细胞内生长有严格的细胞内寄生性，只能在活细胞内生长以核酸复制的方式增殖，不能进行二分裂繁殖以核酸复制的方式增殖，不能进行二分裂繁殖抵抗力特殊：耐冷不耐热，对化学因素的抵抗力较抵抗力特殊：耐冷不耐热，对化学因素的抵抗力较一般比细菌强，耐甘油，对抗生素及磺胺类药物不一般比细菌强，耐甘油，对抗生素及磺胺类药物不敏感，干扰素可抑制病毒复制。敏感，干扰素可抑制病毒复制。病毒感染的实验诊断方法病毒感染的实验诊断方法 n病原学诊断病原学诊断 病毒分离培养病毒分离培养显微镜检查显微镜检查抗原检测抗原检测核酸检测核酸检测n血清学诊断血清学诊断 抗体检测抗体检测 IgM、IgG一、标本采集、运送和处理一、标本采集、运送和处理（一）标本采集（一）标本采集采集时间：尽早采集（越早越好）采集时间：尽早采集（越早越好）标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择标本种类型选择标本种类无菌采集标本：必要时用抗生素或抗真菌药处理无菌采集标本：必要时用抗生素或抗真菌药处理抑制细菌生长抑制细菌生长 100U/ml青霉素青霉素100g/ml链霉素链霉素抑制真菌生长抑制真菌生长 2.5gg/ml二性霉素二性霉素B 或或40 g/ml制霉菌素制霉菌素血清学检查标本：双份血清血清学检查标本：双份血清（二）标本的运送与保存（二）标本的运送与保存1.低温送检低温送检 4可保存数小时，可保存数小时，- -70可长期保存可长期保存 - -10 - -20下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本对冷冻标本应避免反复冻融对冷冻标本应避免反复冻融2.保湿送检保湿送检50%甘油盐水保存送检甘油盐水保存送检 病毒转运培养基（病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM）含）含0.5%明胶或牛血清白蛋白的明胶或牛血清白蛋白的Hanks液液3.无菌送检无菌送检抑制细菌生长抑制细菌生长 100U/ml青霉素青霉素100g/ml链霉素链霉素 抑制真菌生长抑制真菌生长 2.5gg/ml二性霉素二性霉素B 或或40 g/ml制霉制霉菌素菌素二、病毒的形态学检查二、病毒的形态学检查1. 光学显微镜检查光学显微镜检查 n主要观察病变组织中的包涵体，某些大病毒也通主要观察病变组织中的包涵体，某些大病毒也通过光学显微镜观察。过光学显微镜观察。n简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后不形成包涵体不形成包涵体 狂犬病毒胞浆内包涵体狂犬病毒胞浆内包涵体（内基小体）（内基小体）巨细胞病毒胞核内包涵体巨细胞病毒胞核内包涵体（猫头鹰眼）（猫头鹰眼）2. 电镜及免疫电镜检查电镜及免疫电镜检查直接检查标本中的病毒颗粒，快直接检查标本中的病毒颗粒，快速，可确诊。但敏感性低（速，可确诊。但敏感性低（10106 6/ml/ml）免疫电镜敏感性高，但只能用于免疫电镜敏感性高，但只能用于已知病毒的检测）已知病毒的检测）乙型肝炎病毒电镜图 轮状病毒电镜图 三、病毒的分离与鉴定三、病毒的分离与鉴定动物接种动物接种组织培养组织培养标本采集标本采集标本处理后接种标本处理后接种鸡鸡胚接种胚接种卵黄囊膜卵黄囊膜尿囊液尿囊液羊膜腔液羊膜腔液绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜观察囊膜病变观察囊膜病变血凝试验血凝试验血凝抑制试验血凝抑制试验CPEEM包涵体包涵体空斑试验空斑试验红细胞吸附红细胞吸附中和试验中和试验观察发病观察发病抗原检测抗原检测抗体检测抗体检测病理检查病理检查（一）病毒的分离（一）病毒的分离n组织培养组织培养n鸡胚培养鸡胚培养n动物接种动物接种1. 组织培养组织培养n将将人人或或动动物物离离体体的的活活组组织织或或分分散散的的活活细细胞胞在在体体外外人工控制的条件下使其生长繁殖的一种技术。人工控制的条件下使其生长繁殖的一种技术。组织培养的类型组织培养的类型:（1）组织块培养）组织块培养（2）器官培养）器官培养 人胚气管呼吸道病毒；人胚气管呼吸道病毒； 人胚肠人胚肠 肠道病毒肠道病毒（3）细胞培养）细胞培养 最常用最常用q原代和次代细胞培养原代和次代细胞培养 q二倍体细胞培养二倍体细胞培养q传代细胞培养传代细胞培养n动动物物新新鲜鲜组组织织（人人胚胚肾肾等等）胰胰酶酶消消化化营营养养液培养液培养单层细胞（原代细胞）单层细胞（原代细胞）n原原代代细细胞胞胰胰酶酶消消化化转转种种培培养养（次次代代培培养养细细胞）胞）n对病毒敏感，但制备费时费力，只能传对病毒敏感，但制备费时费力，只能传23代。代。 原代和次代培养细胞原代和次代培养细胞二二倍倍体体细细胞胞株株 原原代代细细胞胞反反复复传传代代（5070代代）仍仍保保持持二二倍倍体体染染色色体体特特性性。病病毒毒分分离离和和疫疫苗苗制制备的首选细胞株。备的首选细胞株。传传代代细细胞胞株株 来来源源于于肿肿瘤瘤细细胞胞或或突突变变的的二二倍倍体体细细胞胞，能能在在体体外外无无限限增增殖殖。增增殖殖快快，不不易易衰衰老老，易易于于传传代代保保存存。常常用用于于病病毒毒的的分分离离鉴鉴定定，但但不不能用于制备疫苗。能用于制备疫苗。优点优点细胞来源广、敏感细胞株多细胞来源广、敏感细胞株多不受机体免疫因素的影响，个体差异小不受机体免疫因素的影响，个体差异小病变结果易于观察病变结果易于观察可用于病毒的分离鉴定和制备疫苗及抗原可用于病毒的分离鉴定和制备疫苗及抗原缺点缺点条件要求相对较高，有细胞培养条件的实验室条件要求相对较高，有细胞培养条件的实验室才能做才能做2. 鸡胚培养鸡胚培养新鲜受精卵新鲜受精卵 接种病毒接种病毒3839713d卵黄囊接种（流行性脑炎病毒）卵黄囊接种（流行性脑炎病毒）羊膜腔接种（流感病毒）羊膜腔接种（流感病毒）尿囊腔接种（传代培养）尿囊腔接种（传代培养）绒毛尿囊膜接种（痘类病毒）绒毛尿囊膜接种（痘类病毒）绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤优点优点n鸡胚来源充足，操作简便，有多种接种途径鸡胚来源充足，操作简便，有多种接种途径n病毒增殖快，可收获大量病毒病毒增殖快，可收获大量病毒n鸡鸡胚胚本本身身是是无无菌菌的的，对对接接种种的的病病毒毒不不产产生生抗抗体体缺点缺点n易易感感病病毒毒少少，目目前前主主要要用用于于流流感感病病毒毒、腮腮腺腺炎病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养。炎病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养。n某些病毒在鸡胚内传代后，其毒力下降某些病毒在鸡胚内传代后，其毒力下降3. 动物接种动物接种n常用动物常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不不同同病病毒毒对对动动物物的的敏敏感感性性不不同同，根根据据病病毒毒种种类类加以选择。加以选择。n接种途径接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：q乙型脑炎病毒及狂犬病毒乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种小鼠脑内接种q柯萨奇病毒柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种乳鼠腹腔接种q乙肝病毒乙肝病毒 黑猩猩静脉注射黑猩猩静脉注射q流感病毒流感病毒 鼻腔滴种鼻腔滴种n用途用途 分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清优点优点n方法简单、结果易于观察方法简单、结果易于观察n选择适当的接种途径，可出现类似人类的感染选择适当的接种途径，可出现类似人类的感染症状，有利于发病机制的研究症状，有利于发病机制的研究缺点缺点n可自然带毒或隐性感染，干扰实验结果可自然带毒或隐性感染，干扰实验结果n有个体差异有个体差异n很多病毒无敏感动物，或感染后不出现明显症很多病毒无敏感动物，或感染后不出现明显症状状（二）病毒的鉴定（二）病毒的鉴定病毒的初步鉴定病毒的初步鉴定n动物感染：敏感动物范围、潜伏期及发病情况动物感染：敏感动物范围、潜伏期及发病情况n鸡鸡胚胚接接种种：病病毒毒对对鸡鸡胚胚的的敏敏感感性性、特特殊殊病病灶灶（如痘疱等）（如痘疱等）n细胞培养：病毒在细胞培养中的表现细胞培养：病毒在细胞培养中的表现n理化性质的测定：主要用于新病毒的鉴定理化性质的测定：主要用于新病毒的鉴定病毒的最后鉴定病毒的最后鉴定n血血清清学学鉴鉴定定: 中中和和试试验验、补补体体结结合合试试验验、血血凝凝抑制试验等。抑制试验等。 分离的新病毒，必须进行系统的全面鉴定分离的新病毒，必须进行系统的全面鉴定病毒在细胞培养中的表现病毒在细胞培养中的表现1. 细胞代谢作用改变细胞代谢作用改变（培养液颜色变化）（培养液颜色变化）n正常细胞代谢：正常细胞代谢： 培养液由红变黄培养液由红变黄n病病毒毒增增殖殖，抑抑制制细细胞胞代代谢谢：培培养养液液颜颜色色不不变变或更红或更红 n病病毒毒在在细细胞胞内内增增殖殖后后，使使宿宿主主细细胞胞的的形形态态发发生生不不同同程程度度改改变变，称称为为细细胞胞病病变变效效应应（cytopathiccytopathic effecteffect，CPECPE）。）。2. 细胞形态改变细胞形态改变n细胞变圆、融合、肿胀、细胞空细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核浓缩、形成嗜酸性或嗜碱泡、核浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。性包涵体等。n 某些病毒感染细胞某些病毒感染细胞后不出现后不出现CPE3. 干扰现象（干扰现象（interference）n当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为其中一种病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的病毒的干扰现象干扰现象。n干扰现象也可被相应特异性抗体抑制，称为干扰现象也可被相应特异性抗体抑制，称为干干扰抑制现象扰抑制现象鼻鼻.无无CPE鼻鼻V.Poli.V无无CPEPoli.V有有CPE4. 红细胞吸附及吸附抑制试验红细胞吸附及吸附抑制试验n受受感感染染的的宿宿主主细细胞胞膜膜含含病病毒毒抗抗原原（血血凝凝素素），可可吸吸附附鸡鸡、豚豚鼠鼠或或猴猴红红细胞。细胞。n 如如果果在在培培养养瓶瓶中中加加入入相相应应的的血血凝凝素素抗抗血血清清，则则不不出出现现红红细细胞胞吸吸附附现现象象，即即红红细细胞胞吸吸附附抑抑制制试验阳性试验阳性病毒的理化性质测定病毒的理化性质测定n主要用于新病毒的鉴定主要用于新病毒的鉴定1. 病毒的大小及形态病毒的大小及形态 ：电镜直接观察及测量：电镜直接观察及测量2. 核酸类型核酸类型: 用用RNA酶或酶或DNA酶处理病毒。酶处理病毒。3. 乙醚敏感试验乙醚敏感试验: 有包膜病毒对乙醚敏感，经乙有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性醚作用后，失去感染性4. 耐酸试验耐酸试验 肠道病毒耐酸，在肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳定的环境下稳定，鼻病毒不耐酸，在，鼻病毒不耐酸，在pH3的环境下被灭活的环境下被灭活病毒的血清学鉴定病毒的血清学鉴定n对对初初步步鉴鉴定定为为阳阳性性的的标标本本均均需需要要用用血血清清学学方方法做最后鉴定。法做最后鉴定。n方方法法：血血凝凝抑抑制制试试验验、中中和和试试验验、免免疫疫荧荧光光试验、试验、ELISA等。等。四、病毒的血清学诊断四、病毒的血清学诊断n用已知病毒抗原检测患者血清中的相应抗体，可协助用已知病毒抗原检测患者血清中的相应抗体，可协助诊断病毒感染。诊断病毒感染。n双份血清双份血清IgG测定测定 4倍以上增长，有诊断意义倍以上增长，有诊断意义n单份血清单份血清IgM测定测定 可用于早期诊断，可用于早期诊断，但部分病人可但部分病人可能阴性，少数病人产生的特异性能阴性，少数病人产生的特异性IgM抗体也可抗体也可在体内持续存在在体内持续存在12年。年。病毒血清学试验常用方法病毒血清学试验常用方法（一）中和试验一）中和试验 原理原理 抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。感染性。 V.Ab 失去感染易感细胞的能力失去感染易感细胞的能力 一定量抗体可中和一定量病毒一定量抗体可中和一定量病毒 根据抗体的效价对待测病毒液进行半定量检测。根据抗体的效价对待测病毒液进行半定量检测。中和试验的必要条件：中和试验的必要条件： 1. 活病毒活病毒 2. 敏感细胞、鸡胚或动物敏感细胞、鸡胚或动物中和试验的特点：中和试验的特点：n特异、敏感，既可检测抗体，也可测定抗原特异、敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。（定属、定型）。n既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞培养法最常用。以细胞培养法最常用。n检测检测IgGIgG，不能用于早期诊断，常用于不能用于早期诊断，常用于流行病学流行病学调查调查。（二）补体结合试验（二）补体结合试验n检测检测IgM，常用于早期诊断。常用于早期诊断。n不需活细胞，比中和试验简单，省时。不需活细胞，比中和试验简单，省时。（三）（三）IFIF及及ELISAELISAn方法简单、快速、敏感性高。方法简单、快速、敏感性高。n检测特异性检测特异性IgMIgM，有助于某些病毒感染的早期，有助于某些病毒感染的早期诊断，如：诊断，如：q孕妇羊水中检测孕妇羊水中检测IgMIgM型特异抗体：胎儿先天性感染型特异抗体：胎儿先天性感染q抗抗HBcHBc IgMIgM：作为急性：作为急性HBVHBV感染的指标感染的指标（四）血凝及血凝抑制试验（四）血凝及血凝抑制试验含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应或禽类的红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制，称为血凝抑制试验，可用于病的血凝素抗体抑制，称为血凝抑制试验，可用于病毒的分型。毒的分型。五、病毒抗原检查五、病毒抗原检查nDFADFA、IFAIFA、IEAIEA等。等。n可检测细胞内、外的游离病毒抗原。可检测细胞内、外的游离病毒抗原。n敏敏感感、特特异异，简简便便、快快速速。适适用用于于多多种种病病毒毒性性疾病的早期快速诊断。疾病的早期快速诊断。Influenzavirus A培养物DFA染色阳性 生殖道HSV-2涂片DFA染色阳性六、病毒的分子生物学检测六、病毒的分子生物学检测n分子生物学方法可检测以不同形式存在的病毒基分子生物学方法可检测以不同形式存在的病毒基因片断。因片断。n方法敏感、特异、简便、快速。方法敏感、特异、简便、快速。q核酸电泳技术核酸电泳技术q核酸杂交技术核酸杂交技术qPCRq基因芯片技术基因芯片技术