福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院 实验一实验一培养基的配制与灭菌培养基的配制与灭菌 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院一 实验目的了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院二 实验原理v人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。良好的营养条件。v培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。分的营养物质调制而成的营养基质。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院营养六要素碳源：碳源：提供微生物繁殖所需碳元素的营养物质。用途：糖、蛋白质、核酸合成。氮源：氮源：提供微生物繁殖所需氮元素的营养物质。用途：蛋白质、核酸合成。能源：能源：提供微生物生命活动最初能量来源的营养物或辐射能。生长素：生长素：微生物生长必需，但又不能自行合成的有机物。无机盐：无机盐：提供微生物繁殖所需各种重要元素。水分：水分：水是保证生命活动重要的介质。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院培养基的种类培养基的种类据组成成分可分为据组成成分可分为: : 1. 合成培养基：合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。由各种纯化学物质按一定比例配制而成。（如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。）（如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。） 2. 半合成培养基：半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。（如马铃薯蔗糖培养基。）物质配制而成。（如马铃薯蔗糖培养基。） 3. 天然培养基：天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。利用天然来源的有机物配制而成。 （如牛肉膏（如牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。）培养基、麦芽汁培养基等。） 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院从培养基的物理状态可分为从培养基的物理状态可分为 1. 液体培养基：液体培养基：不加凝固剂（常用凝固剂为琼脂）的液体状态培养基。 2. 固体培养基：固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3. 半固体培养基：半固体培养基：在液体培养基中加入0.2-0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院按照培养基的用途，可将其分为：按照培养基的用途，可将其分为：l加富培养基：加富培养基：加富培养基是指在普通培养基里加过血、血清、动物（或植物）组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基，用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物l选择培养基：选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。l鉴别培养基：鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院v 配制培养的各类营养物质和容器等含有各种配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物微生物v 微生物生长繁殖：微生物生长繁殖： 消耗养分消耗养分 改变培养的酸碱度改变培养的酸碱度 产生毒素或者抑制物产生毒素或者抑制物培养基灭菌 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院灭菌方法灭菌方法 加热灭菌加热灭菌干热灭菌干热灭菌湿热灭菌湿热灭菌 过滤除菌过滤除菌 辐射灭菌辐射灭菌放射线辐照灭菌放射线辐照灭菌紫外线灭菌紫外线灭菌 化学药品灭菌化学药品灭菌 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院加热灭菌加热灭菌干热灭菌干热灭菌v干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。v细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。v因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160170），时间要长（12h），但干热灭菌温度不能超过但干热灭菌温度不能超过180180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃燃烧烧。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院湿热灭菌湿热灭菌 高压蒸气灭菌是将待灭菌的高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于使沸点增高，得到高于100100的温的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜大，三是湿热的蒸气有潜热存在。这种潜热，能迅热存在。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。从而增加灭菌效力。1g水在水在100时，由气态变时，由气态变为液态时可放出为液态时可放出2.26kJ(千千焦焦)的热量。的热量。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。温度低于饱和蒸气的温度。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院 一般培养基用0.1Mpa0.1Mpa，121.5,15121.5,1530min30min可达到彻底灭菌的目的。可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院过滤除菌过滤除菌 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。清），一般可用细菌过滤器进行除菌。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院紫外线灭菌法紫外线灭菌法 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200-300nm200-300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm260nm的杀菌力最强的杀菌力最强。在。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和二聚体的形成和DNADNA链的交联，从而链的交联，从而抑制了抑制了DNADNA的复制的复制。另。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成OO，再使，再使O O2 2氧氧化生成臭氧（化生成臭氧（O O3 3）或使水（）或使水（H H2 2O O）氧化生成过氧化氢（）氧化生成过氧化氢（H H2 2O O2 2）。）。O O3 3和和H H2 2O O2 2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m1.2m为宜。为宜。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院 为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前；可在无菌室内前；可在无菌室内( (或接种箱内或接种箱内) )喷洒喷洒3%3%5%5%石炭石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用的桌面、凳子可用2%2%3%3%的来苏尔擦洗，然后再的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌灭菌目目的。的。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院化学药品灭菌化学药品灭菌 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院三 实验材料药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蔗糖；可溶性淀药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蔗糖；可溶性淀粉、粉、K K2 2HPOHPO4 4、KNOKNO3 3、MgSOMgSO4 4 7H7H2 2O O、FeSOFeSO4 47H7H2 2O O等。等。高压蒸汽灭菌锅、恒温干热灭菌箱、超净工作台。高压蒸汽灭菌锅、恒温干热灭菌箱、超净工作台。其它：天平、牛角匙、电炉、其它：天平、牛角匙、电炉、1MHCl1MHCl、1MNaOH1MNaOH、pHpH试纸、试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、玻璃珠、三角刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、玻璃珠、三角瓶、带塞子的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、瓶、带塞子的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、标签等。各种包装纸、防水纸、标签等。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院四 实验步骤6. 加塞7. 包扎8. 灭菌9. 搁置斜面10. 无菌检查1.称量2.溶化3.调pH4.过滤5.分装 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院称量：称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。溶化：溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。调调pH值：值：用1MNaOH或1MHCl调pH，用pH试纸对照。加琼脂溶化：加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。分装：分装：注意不要污染棉塞。包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。灭菌备用：灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院几种常用培养基配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 水 1000ml pH 7.47.6。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院高氏高氏号培养基配方如下：号培养基配方如下： 可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1gK2HPO43H2O 0.5gMgSO47H2O 0.5gFeSO47H2O 0.01g 琼脂 1525g 水 1000mL pH 7.47.6 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院马铃薯培养基配方：马铃薯培养基配方： 马铃薯 200g葡萄糖 20g琼脂 l520 g蒸馏水 l000mL pH 自然 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院阿斯毕无氮培养基：阿斯毕无氮培养基：甘露醇（或蔗糖、葡萄糖）甘露醇（或蔗糖、葡萄糖） 10gKH2PO4 0.2gMgSO4.7H2O 0.2gNaCl 0.2gCaSO4.2H2O 0.1gCaCO3 5g琼脂琼脂 20g 水水 1000mlPH 自然自然 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院五 注意事项n在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气要尽可能排除完；n易燃易爆物品（如：硝化甘油、硝化纤维、黄磷、红磷、乙醚、汽油及可燃性气体等）不能用高压灭菌法灭菌；n当含盐类的液体和含盐的琼脂中大量的盐类泼洒在工作腔体，要立即换水，冲洗腔体，仔细擦干锅盖垫圈上的水滴。否则它们会带来腐蚀和变质。要检查压力表上的指数为“0Mpa”后才能打开锅盖。n外来物质（金属、液体）不能堵塞通风孔，否则会引起装置故障、起火、短路。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院n蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛交匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。n在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。n分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免污染棉塞而引起污染。n分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶体的1/2 。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院六 思考题n1.1.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？n2.2.在配制培养基的操作过程要注意哪些问题？在配制培养基的操作过程要注意哪些问题？n3.3.高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的冷空气完全排尽？冷空气完全排尽？ 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院一、自生固氮菌的分离纯化1、富集培养（下周上课时自带土壤（下周上课时自带土壤偏碱性土壤）偏碱性土壤）一组5人，每人做1皿（共5皿，灭菌时5个一包）；需要1瓶阿斯毕培养基倒平板（100ml左右）2、划线分离每人做2皿（共10皿，灭菌时10个一包）；需要2瓶阿斯毕培养基倒平板（200ml左右）3、斜面保藏每人保藏2根斜面（共10根）.配培养基时做好10根阿斯毕无氮培养基斜面。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院二、土壤平板稀释计数1、梯度稀释（下周自带（下周自带10g以上的土壤）以上的土壤）一个带玻璃珠的250ml三角瓶，内装90ml蒸馏水；6个装有9ml蒸馏水用于梯度稀释的18*180试管；1ml移液管1支。2、涂平板 5个人每人做1个浓度，每个浓度做3个重复，即每个浓度涂3皿（共15皿，灭菌时6个一包，9个一包）需要3瓶牛肉膏蛋白胨培养基倒平板（300ml左右）3、每天都要有人来观察计数，具体计数规则见实验指导。 福建农林大学生命科学学院福建农林大学生命科学学院每一小每一小组讨论所有的所有的实验哪哪些耗材需要些耗材需要灭菌？菌？实验前都前都该做哪些准做哪些准备工作？工作？