急性毒性试验设计一、急性毒性一、急性毒性 急急性性毒毒性性指指人人或或动物物一一次次或或24 h之之内内多多次次接接触触外外源源化化学学物物后后，在在短短期期内内所所发生生的的毒毒性性效效应，包包括括致致死死效效应。一一次次：指指瞬瞬间给实验动物物染染毒毒，如如经口、口、经静脉注射染毒。静脉注射染毒。24 h之之内内多多次次：指指外外源源化化学学物物毒毒性性过低，需低，需给予予动物物较大大剂量。量。 急急性性毒毒性性效效应出出现的的快快慢慢和和毒毒性性反反应的的强度度与与外外源源化化学学物物的的性性质和和染染毒毒剂量量的的大大小小有关。有关。 如：丙如：丙烯腈，过氧化二碳酸二氧化二碳酸二环己己酯丙丙烯腈经口急性毒性口急性毒性试验设计实验目的n评价价丙丙烯腈的的毒毒性性作作用用，求求出出半半数数致致死死量量LD50，并根据并根据LD50进行急性毒性分行急性毒性分级，n掌掌握握实验动物物随随机机分分组的的方方法法和和经口口灌灌胃的技胃的技术。n观察察丙丙烯腈急急性性中中毒毒症症状状；为后后续试验提供依据；提供依据；为毒理学机制研究提供毒理学机制研究提供线索。索。器材与器材与试剂n1、实验动物 ICR小鼠（健康成年小鼠）n2、实验器材 灌胃针、注射器、吸管、容量瓶、烧杯、滴管、电子天平、动物体重秤、外科剪刀、镊子 n3、实验试剂 丙烯腈、苦味酸酒精饱和液、伊红染液实验方法方法n1、实验动物的选择n2、剂量设计及随机化分组n3、受试物的配制n4、染毒途径的选择n5、毒性反应的观察与LD50的计算n6、急性毒性的评价 1、物种和品系、物种和品系 对外源化学物毒性反外源化学物毒性反应与人近似易于与人近似易于饲养管理养管理 方便方便实验 操作易于操作易于获得得 繁殖生育力繁殖生育力强 数量数量较大能大能够保障保障 品系品系纯化，价格低廉。化，价格低廉。 一、 实验动物物选择2、 实验动物的年物的年龄与体重与体重 动 物物 大鼠大鼠 小鼠小鼠 豚鼠豚鼠 兔兔 犬犬 猫猫成年年成年年龄（周）（周） 3 2 2 34 34 34 体重（克）体重（克） 150 15 250 1.5kg 715kg 1kg寿命（年）寿命（年） 23 23 68 49 1520 1012n动物数量：物数量：动物物6组，1-5组为实验组，6组为蒸蒸馏水水对照照组n性性别：雌雄各半雌雄各半n年年龄：成年：成年动物物n生理与健康状况：生理与健康状况：未未产未孕者、健康未孕者、健康动物物n实验动物的物的预检n实验动物的物的给药前禁食前禁食处理理。3、实验动物的一般要求物的一般要求健康健康动物物标志志发育正常、体育正常、体态丰丰满、外、外观无畸形；无畸形；被毛被毛浓密、密、贴顺有光有光泽、不蓬乱；、不蓬乱；胸胸阔宽阔、脊柱不弓不弯；、脊柱不弓不弯；眼睛明亮；眼睛明亮；表皮无表皮无溃疡、无、无结痂（注意尾巴）；痂（注意尾巴）；各天然孔干各天然孔干净、无分泌物；、无分泌物；行行动灵活、反灵活、反应敏捷敏捷。实验动物的物的标记染色法染色法 编号方法：小鼠号方法：小鼠头部部为1 1号，号，顺时针编号，用苦味酸号，用苦味酸编个位数，用伊个位数，用伊红编十位数十位数。染色法染色法优点：点： 简单方便，不痛苦，无方便，不痛苦，无损伤。缺点：缺点： 时间较长时，染色，染色剂易褪色；易褪色； 标记容易模糊不清。容易模糊不清。 剂量选择及分组n剂量量选择 广泛广泛查阅文献文献资料，估料，估计毒性中毒性中值预试，求出待，求出待测化学物化学物0 %100 %或或 10 %90 %的大致致死的大致致死剂量范量范围设计正式正式试验的的剂量和分量和分组 预实验：总的原的原则是先用少量是先用少量动物，以物，以较大的大的剂量量间距染毒，求出粗略的致死距染毒，求出粗略的致死剂量范量范围，即确定受即确定受试动物全部致死的最小物全部致死的最小剂量量（b）和全部不致死的最大）和全部不致死的最大剂量（量（a），），即求出待即求出待测化学物化学物0 %100 %的大致的大致致死致死剂量范量范围，然后在，然后在这个个剂量范量范围内内按几何按几何级数的数的间距距设计57个个剂量量组，组间剂量呈等比量呈等比级数（数（r），其比），其比值为。进行正式行正式实验。通通过预试，找出受，找出受试化学物引起化学物引起动物死亡物死亡的大致的大致剂量范量范围，以此，以此为依据依据设计正式正式试验的的剂量和量和分分组。按下式按下式设计剂量量组： 式中：式中：rr相相邻两两组剂量的比量的比值，一般，一般为，bb最低全致死最低全致死剂量量，量量，aa最高不致死最高不致死剂量，量，nn设计的的组数。数。分分组恰当与否也是确保恰当与否也是确保实验结果准确的条件之果准确的条件之一。因一。因为组数数过多，需要消耗多，需要消耗较多的多的动物，物，还可可能出能出现较大大剂量量组动物死亡率低于物死亡率低于较小小剂量量组；组数数过少，不能少，不能较精确求出精确求出LD50。根据公比根据公比(r)计算各算各组剂量量各各组剂量分量分别为 第一第一组：a 第二第二组：a r 第三第三组：a r2 第四第四组：a r3 第五第五组：a r4 第六第六组：a r5 随机化分随机化分组 将将实验动物物编号，从随机数字表上任意横号，从随机数字表上任意横行或行或纵行的任意数字开始，行的任意数字开始，顺序取下数字，序取下数字，标于每个于每个动物号下，然后用物号下，然后用计划划组数去除数去除随机数字，所得余数即随机数字，所得余数即为所属所属组别。以20只只动物的完全随机分配物的完全随机分配为例例动物物编号号1234567891011121314151617181920随即数字随即数字5483805390755378934772095466954468676786除除4后余数后余数23012312130122300332所属所属组别二二三三四四一一二二三三一一二二 一一三三四四一一二二二二三三四四四四三三三三二二完全随机分配后各完全随机分配后各组所属所属动物号物号 组别动物物编号号一一47912二二1581320 14三三26101518 19四四311161720只动物完全随机分配的结果 组别动物物编号号一一4791219 二二1581314 三三2 6101518 四四311161720受受试物的配制方法物的配制方法（1）受）受试化学物的量取化学物的量取：n固体受固体受试物用称量法，液体受物用称量法，液体受试物用称量法或吸量法。物用称量法或吸量法。n称量法：取一定量的受称量法：取一定量的受试物放入已知重量的容器内，称重，物放入已知重量的容器内，称重，定容，定容，计算算浓度度mg/ml，备用。用。n吸量法：依吸量法：依设计剂量量计算出算出应吸取液吸取液态受受试物的容物的容积，加入，加入容量瓶中，用溶容量瓶中，用溶剂加至刻度。加至刻度。吸量法吸量法，计算公式为：X式中： X应吸取受试物的容积； A设计要求的受试物浓度（ mg/ml ）； V容量瓶容积（ml）； d受试化学物比重；A Vd1000受试物的配制方法（2）受）受试化学物的稀化学物的稀释n等浓度稀释法：n等容量稀释法：等等浓度稀度稀释法法 将受将受试物配制成一种物配制成一种浓度，不同度，不同剂量量组实验动物物单位体重所位体重所给受受试物的体物的体积不同，不同，剂量越高，所用的量越高，所用的体体积越大；越大；剂量越低，所用的体量越低，所用的体积越小。比如某受越小。比如某受试物的物的试验剂量分量分别为100、200、400和和800mg/kg，受，受试物配制成物配制成10 mg/ml，每，每组动物物每每10g体重分体重分别给与、和与、和0.8 ml。等容量稀等容量稀释法法 将受将受试物配制成不同物配制成不同浓度，不同度，不同剂量量组实验动物物单位位体重所体重所给受受试物的体物的体积相同，相同，剂量越大，受量越大，受试化学物化学物配制的配制的浓度越高。上例中，若度越高。上例中，若实验动物按容量灌胃物按容量灌胃,则应配制成配制成4个不同个不同浓度度,即即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和和40mg/ml。染毒途径的染毒途径的选择n经消化道染毒：消化道染毒：经口灌胃法口灌胃法 采用采用专用小鼠灌胃用小鼠灌胃针。 左手抓住左手抓住动物双耳后至背部的皮肤，将物双耳后至背部的皮肤，将动物固定成垂物固定成垂直体位，腹部面向操作。直体位，腹部面向操作。 右手持注射器，将右手持注射器，将针头由由动物口腔物口腔侧插入，避牙插入，避牙齿，沿咽后壁沿咽后壁缓缓滑人食管。若遇阻力，可滑人食管。若遇阻力，可轻轻上下滑上下滑动探索，探索，一旦感一旦感觉阻力消失，即深人至胃部。阻力消失，即深人至胃部。 如遇如遇动物物挣扎，扎，应停止停止进针或将或将针拔出，千万不能拔出，千万不能强行插入，以免穿破食，甚至行插入，以免穿破食，甚至误入气管，入气管，导致致动物物 立即死亡。立即死亡。 观察指察指标n中毒症状：确定靶器官中毒症状：确定靶器官 行行动：不安定、多：不安定、多动、发声；声； 神神经系系统反反应：举尾、振尾、振颤、痉挛、运、运动失失调、姿、姿态异常；异常； 自主神自主神经系系统反反应：眼球突出、流涎、流泪、：眼球突出、流涎、流泪、排尿、下泻、排尿、下泻、竖毛、皮肤毛、皮肤变色、呼吸。色、呼吸。n死亡和死亡死亡和死亡时间 n病理学病理学检查及其他指及其他指标 LD50的的计算（改良寇氏法）算（改良寇氏法）n当急性毒性当急性毒性试验的最大的最大剂量死亡率量死亡率为100%，最小，最小剂量的死量的死亡率亡率为0%；各；各组动物数相等；各物数相等；各剂量量组的的组距等比或距等比或剂量量对数等差数等差时，用下述基本公式，用下述基本公式计算算LD50：当不含当不含0%和和100%死亡率死亡率时，用下式，用下式计算算LD50：Xm最大最大剂量量对数数P各各剂量量组死亡率死亡率Pm最高死亡率最高死亡率q各各组剂量存活率，量存活率，q=1-p以上各式中：以上各式中：i组距，即相距，即相邻两两组剂量量对数数剂量之差量之差Pn最低死亡率最低死亡率p各各剂量量组死亡率之和死亡率之和n各各组动物数物数LD50的局限性的局限性n消耗消耗动物量大物量大n获得的信息有限得的信息有限n动物死亡和物死亡和观察的症状不足以反察的症状不足以反应生理学、生理学、血液学和其它化血液学和其它化验检查所提供的毒性信息所提供的毒性信息n有有许多因素影响多因素影响LD50值的的测定，定，实际上上测得得的的LD50是近似是近似值 n急性毒性急性毒性试验不等于不等于LD50测定定n可用少量可用少量动物物测定定ALD，并，并进行行临床床观察、化察、化验检查和病理学和病理学检查n当口服当口服剂量大于量大于5g/kg或注射或注射剂量大于量大于2g/kg时，不，不产生急性毒性或死亡，生急性毒性或死亡，则不不必准确的必准确的测定定LD50注意注意急性毒性评价 外源化学物相外源化学物相对毒性分毒性分级标准准 急性毒性分急性毒性分级（WHO）