膜片钳技术讲座1 在膜片钳技术及应用（2003）一书的序言中写道： 通常，一篇非常专业的科技论文公开发表后，若被其他的论文引用数次，其作者就会感到欣慰；假如被别的作者引用十次以上，就可称得上是一篇好论文；要是有幸被引用几十上百次，甚至几百次，那它无疑是一篇高质量杰作，通常发表在权威的专业期刊或者是著名的科学杂志上，如“Nature” ，“ Science”， “ Cell”和“ Neuron”等。2 然而，你是否知道？有一篇论文，它的作者当时还不太有名，刊登的杂志也不算顶级，可是论文发表20年来，已神话般地被世界各地的科技工作者引用了一万二千余次，遍及生物医学的众多领域，而且近年来还在以平均每年约一千多篇的速度继续被引用，它就是由Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人于1981年发表在欧洲生理学杂志上的著名论文。在此之前五年，身为德国科学家的Neher和Sakmann共同发明了膜片钳技术（1976），并于15年后共同荣获1991年诺贝尔 生理学或医学奖。3目目 录录 一、离子通道的概念一、离子通道的概念 二、离子通道的分子结构二、离子通道的分子结构 三、离子通道的分类三、离子通道的分类 四、离子通道的研究技术四、离子通道的研究技术 五、膜片钳实验方法五、膜片钳实验方法 六、膜片钳改良模式及其它研究方法六、膜片钳改良模式及其它研究方法4一、离子通道的概念一、离子通道的概念 离子通道（ion channels）是镶嵌在细胞膜脂质双分子层上的一种特殊整合蛋白，在特定情况下，形成具有高度选择性的亲水性孔道，允许适当大小和电荷的离子以被动转运的方式通过。 56 离子通道具有两大共同特征，即离子选择性及门控特性。选择性包括通道对离子大小的选择性及电荷选择性，如安静时神经细胞膜离子通道对K+的通透性比Na+大100倍，而神经兴奋时，对Na+通透性又比K+大1020倍。通道闸门的开启和关闭过程称为门控门控（gating）。通道可表现为三种状态，即备用、激活及失活状态。 7二、离子通道的分子结构二、离子通道的分子结构 随着生物物理学和分子生物学的迅速发展，新的研究技术的应用，特别是膜片钳片技术与分子克隆、基因突变和异体表达等技术的结合，使离子通道的研究迅速进入到分子、亚分子水平，人们已开始有能力从分子水平来确定通道的分子结构和解释离子通道的孔道特性。 8电压门控离子通道的基本结构 经纯化、克隆和测定表明，离子通道蛋白是由多个亚基构成的复合体。电压门控离子通道由、等亚基构成，但不同的离子通道的组成略有差异，如钠通道由、1 、 2和3 、 4亚基组成，钙通道由1、2、和亚基组成，钾通道由和亚基组成等。在各亚基中，亚基是构成离子通道的主要功能单位，而其它亚基则只起调节作用。 9111213 当膜去极化时，每一个功能区的S4肽段做螺旋运动而使正电荷移出产生微弱而短暂的门控电流，导致通道构象变化。当四个结构域S4肽段均发生这种构象变化时，则通道便处于激活开放状态，因此，S4肽段又称为激活闸门（activation gate, m闸门）在通道开放后，很快结构域的S6与功能区的S1之间的肽链构成失活闸门（inactivation gate, h闸门），形成一“活瓣”，将通道内口阻塞，调控通道的失活过程。1415化学门控离子通道的基本结构 当各种化学物质与化学门控离子通道相应部位结合后，会导致通道蛋白发生构型变化，引起通道开放，产生离子电流。体内这种离子通道的种类很多，主要包括各种神经递质门控离子通道、ATP敏感钾通道和钙依赖性钾通道等。 神经递质门控离子通道又称为离子通道受体，主要有乙酰胆碱门控离子通道、GABA门控离子通道及谷氨酸门控离了通道三大类。 16乙酰胆碱门控离子通道 由12 五个亚基组成，呈五边形排列。每个亚基有4个跨膜区段即M14，由五个亚基的M2共同构成孔道的内壁。在1和2亚基N端的细胞外部分各有一个ACh结合位点，当两个ACh分子与亚基结合后，便引起通道蛋白的构象变化和通道开放，主要引起Na+内流增多。1718三、离子通道的分类三、离子通道的分类非门控离子通道 门控离子通道 电压门控性通道化学门控性通道机械门控性通道19 1、非门控性离子通道 有些离子通道始终处于开放状态，离子可随时进出细胞，并不受外界信号的明显影响，这些通道称为非门控离子通道。如神经和肌肉细胞静息电位就是由于细胞膜上的离子通道允许K+自由进出细胞，而引起的K+电化学平衡电位，此种K+通道即属于非门控性离子通道。 20 2、电压门控离子通道 电压门控离子通道（voltage-gated ion channels）又称电压依赖性离子通道，这一类通道的开启或关闭受膜电位的变化决定，具有电压依赖性和时间依赖性。电压门控离子通道一般以最容易通过的离子命名，如钠离子通道、钙离子通道及钾离子通道等。 21 电压门控钠离子通道 钠离子通道（sodium channels，简称钠通道），是选择性地容许Na+跨膜通过的离子通道。根据其对钠通道阻滞剂河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）和-食鱼螺毒素（-conotoxin,- CTX）的敏感性不同分为神经类、骨骼肌类和心肌类钠通道三类。 22电压门控钙离子通道 钙离子通道（calcium channels，简称钙通道）是选择性容许Ca2+跨膜通过的离子通道。根据肌细胞和神经元电压门控离子通道对膜电位变化的敏感性，将神经元质膜电压门控钙离子通道分为T、L及N三种类型，后来应用不同的毒素阻断钙电流的某种特定的成分，在神经元又增加了P、Q和R型，共6型。 23电压门控钾离子通道 钾离子通道（potassium channels，简称钾通道）是广泛存在、种类最多、最为复杂的一大类离子通道，仅电压门控钾通道就已克隆出几十种亚型，根据其电流动力学特点可分为延迟外向整流钾通道、瞬时外向钾通道和内向整流钾通道三类。 243、化学门控离子通道 化学门控离子通道（chemically gated ion channels）又称配体门控通道（ligand gated channels）。这一类通道的门控行为主要受其相应配体的控制，配体是包括神经递质、激素等各种激动剂和阻滞剂在内的多种化学因素。当激动剂与化学门控离子通道结合后，会引起通道蛋白构型变化，导致通道开放，产生离子电流。254、机械门控离子通道 机械门控离子通道（mechanically gated ion channels）是由机械牵拉激活的离子通道，主要见于触觉和听觉感受器，如声波传入内耳后，引起内耳毛细胞顶端纤毛发生弯曲或偏斜，从而使毛细胞顶端机械门控通道开放，阳离子内流产生听觉的感受电位。26 5、其它门控离子通道 除上述离子通道外，尚发现具有其它门控特性的离子通道存在，如细胞容积敏感的钾通道（Kvo l）在细胞肿胀时通道开放；Na+激活钾通道（KNa）对电压、细胞内ATP浓度及细胞内钙均不敏感，只有细胞内Na+浓度升高到20mmol/L以上时开放；存在于多种肌细胞的静息活化钙通道，在没有电压、化学或机械刺激时，参与静息钙内流，调制静息时的细胞内钙浓度。 27四、离子通道的研究技术四、离子通道的研究技术281、电压钳技术 电压钳技术是1949年Cole及Marmont设计的，后经Hodgkin、Huxley 和Katz等加以改进，并成功地应用于枪乌贼巨轴突动作电位期间离子电流的研究。 他们直接测定了膜电流并分析了电流的离子成分，推算出动作电位期间钠电导和钾电导的变化，其基本概念至今仍被沿用。鉴于Hodgkin、Huxley 和Eccles 对通道研究的突出贡献，获得1963年诺贝尔医学或生理学奖。29A.L.Hodgkin 19141998A.F.Huxley 191730 电压钳技术是通过一个反馈电路使膜电位保持在指定的水平，当离子通道开放产生跨膜电流，导致膜电位改变时，可通过反馈电路经微电极向胞内注入电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流，使膜通透性发生改变时膜电位保持不变，此时注入电流的变化就可反应膜电导或膜电流的改变。电压钳技术工作原理如示意图：3132332 2、膜片钳技术、膜片钳技术 1976年Neher和Sakmann完成电极与膜之间50M的封接，首次记录到去神经蛙肌纤维膜上的单通道电流，为证实生物膜离子单通道是以全或无规律、随机开放关闭的假说提供了有力依据。但是，当时实验记录的背景噪声较大。1980年，Neher利用负压吸引实现了G封接，背景噪声显著减低。1991年膜片钳技术的创始人Neher和Sakmann荣获诺贝尔医学或生理学奖。34Patch clamp Erwin Neher Bert Sakmann 1944 194235 膜片钳技术是用尖端直径12m的玻璃微电极吸管与经蛋白酶处理干净的细胞膜接触，通过2030cm H2O的负压吸引造成电极尖端与细胞膜形成高阻封接（10100G），使电极尖端下的小块膜片与膜的其它部分在电学上绝缘，并在此基础上固定膜片电位，监测几个m2膜片上13个离子通道活动的方法。 膜片钳技术可用一根玻璃微电极同时完成膜片（或全细胞）电位的监测、钳制及通道电流的记录。 36 膜片钳技术具有1pA的电流分辨率，10 s的时间分辨率和1 m2 的空间分辨率，使其成为在活体细胞上进行电生理学研究的重要手段。 随着该技术的逐渐完善及应用，目前已成为从功能角度探讨各种生理、病理生理及药物作用机制最直接、最理想的电生理学研究方法，也为多学科探讨生命活动规律、疾病与转归机理及药物作用等细胞和分子水平的研究，开辟了广泛前景。3738 3 3、膜片钳记录的模式、膜片钳记录的模式 根据研究需要及记录膜片的不同，膜片钳记录可形成以下四种基本模式 1.细胞贴附式（cell attached patch） 2.内面向外式（inside-out patch） 3.外面向外式（outside-out patch） 4.全细胞记录式（whole cell recording） 394041 4 4、膜片钳实验系统的组建、膜片钳实验系统的组建 膜片钳实验系统虽然可因研究目的不同而有所区别，但其基本组成是相同的，包括膜片钳放大器和接口，显微镜和视频监视器以及防震台和屏蔽罩等。 4243视频监视频监视器视器温度控温度控制系统制系统倒置显倒置显微镜微镜探探头头微操纵微操纵器器模数转模数转换器换器膜片钳膜片钳放大器放大器数据采数据采集及分集及分析软件析软件计计 算算机机44五、膜片钳实验方法五、膜片钳实验方法 膜片钳实验方法包括：微电极的制备细胞标本的制备高阻封接的形成离子单通道电流的记录或全细胞记录4546 1、微电极的制备 微电极是用拉制器由玻璃毛细管拉制而成。玻璃微电极的选材和拉制质量直接影响封接电阻及记录时的噪声大小。 （1）选材 膜片钳实验用微电极可根据不同记录模式选用不同的玻璃毛细管拉制。从玻璃毛细管材料方面,可分为软质玻璃和硬质玻璃两类。47 （2）拉制 膜片钳实验用微电极与细胞外记录和细胞内记录用微电极不同，其尖端较短，锥度较大，尖端直径为15m，充灌林格氏液时阻抗约15M，因此一般采用两步拉制法。第一步将玻璃软化，拉出一个长710mm、直径200400m的杆，第二步再从杆中央以较小电流拉出两根尖端锥度较大的微电极。48 （3）处理 微电极拉制成功后，其尖端需进一步处理。这一过程包括涂硅酮树酯（sylgard coating）和热抛光（heat polish）。前者是将硅酮树酯涂于微电极尖端以外部分，达到使浸入浴液中的微电极表面呈疏水性，减小电极内部与溶液之间的电容。 热抛光是在显微镜下，将微电极尖端接近热源（通电加热的铂丝或白金丝等），使电极尖端表面变得更加宽阔和光滑，经热抛光处理的微电极可使高阻封接的成功率明显提高。 49 （4）充灌 微电极使用前要充灌电极内液，电极内液需经0.2m的滤膜或滤纸过滤。充灌时首先将电极尖端浸入电极内液，利用虹吸作用使尖端部分充满液体，然后再从电极尾端充灌。在充灌中应避免电极内出现气泡，如有气泡可使电极尖端向下，轻敲管壁除去。也应避免充灌电极内液太多，否则影响实验噪声基线。 502、细胞标本的制备 除脑片膜片钳和盲膜片钳法之外，实验所需标本均为具有生物活性的离体细胞，其来源包括急性分离、原代和传代培养的细胞。从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固程度不同，采用的分离方法也不完全相同。大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及清洗等步骤。513、高阻封接的形成 高阻封接形成与否是记录细胞离子通道电流能否成功的前提，是进行膜片钳实验的关键一步。微电极尖端与细胞膜形成封接的过程，可以采用软件或刺激器发出1mV脉冲电压作用于微电极，造成膜两侧电位差发生变化，产生电极电流，再通过示波器或显示屏，观察电极电流幅度的变化来确定封接程度。在电极未入溶液之前，在显示器或示波器上可见一直线。 5253 进行高阻封接时，需注意的是： 在微电极未入液之前常施以正压，防止浴液表面灰尘或溶液中粒子附着于电极尖端，影响高阻封接。 电极尖端与细胞膜接触，稍加负压后电流波形变得平坦，此时，如使电极超极化，则有助于加速形成高阻封接。 电极入液后封接的成功率与入浴液后的时间呈反比，电极内液中的肽类或蛋白质成分也会有碍于封接形成。 54 4 4、离子通道电流的记录离子通道电流的记录55 单通道电流记录 离子单通道电流的记录是膜片钳技术的最大优势，当尖端直径为1m的玻璃微电极与细胞膜形成高阻封接后，根据单通道电流的特征，很容易得到对某种离子有选择性通透的单一的离子通道电流。由于单通道电流大小仅为1pA（10-12A）左右，要记录到这一微小电流，除尽量降低膜片钳系统噪声及电极噪声外，良好的高阻封接是获得低噪声记录的先决条件。5657 全细胞电流记录 全细胞记录是膜片钳四种基本模式之一。尽管它记录的是细胞膜多个离子通道开放产生的宏膜电流，但由于该模式既可以对离子通道的性质和分类进行宏观性质的分析，也可以对离子通道的构造、分布与功能进行微观性质的分析，从而使其成为当前电生理研究中应用最广泛的一种模式。58全细胞记录模式可用于测定在某个时间和电压情况下，离子通道电流的大小，观察其电压依赖性特征，如以膜电位为横座标，电流强度为纵座标，则可绘制出电流-电压关系曲线（I-V曲线）。在电流为零时的膜电位被称为反转电位。 I-V曲线和反转电位反映了某种通道的电压依赖性及药物等因素对通道电压依赖性的影响，常作为全细胞记录模式结果分析的指标之一。59606162636465666768 钠通道的激活是电压门控的，当细胞膜去极化至-60mV左右时，即可引起膜上大量钠通道激活，产生一迅速激活并迅速失活的内向电流，当去极化至-30 mV左右时达到最大，反转电位为+30 mV左右。在参数设计上应使保持电位钳制在-80 mV以下，此时给予不同程度的去极化阶跃电压，则可得到钠电流，由于钠通道激活和失活均很快，因此刺激脉冲波宽常为2050 ms。 钠通道电流的测定69 为证实所测电流为钠电流，常借助于工具药，如河豚素（TTX）用于细胞外液中，可以选择性阻断钠通道。由于神经与心脏中的钠通道亚型不同。心肌钠通道对TTX的敏感度比神经低数百倍。 当膜电位钳制在-80 mV，去极化中还可能引起某些钾通道成分的激活，此时可使用钾通道阻断剂或将电极液中KC1以CsC1取代可起到抑制钾通道激活的作用。70 钙通道电流的测定（1）L型钙通道: 膜电位钳制在-60 mV，这样即较大程度的激活了L型钙通道，又有效的抑制了钠通道；激活与失活时间较长，因此去极化脉冲的保持时间在200500 ms之间；L型钙通道的最大电流约在0+10 mV；反转电位为+40+50 mV左右。 L型钙通道除对二氢吡啶、Verapamil以及硫氮卓酮等钙拮抗剂敏感外，对某些无机离子如Cd2+也很敏感，20M Cd2+就可使钙通道活性抑制90%以上，常被用作全细胞膜片钳实验中的工具药。71值得注意的是，L型钙通道电流测定时,可随时间产生衰减,即所谓run-down现象。尽管许多学者进行了大量的研究，但仍不能有效地防止这一现象，严重时在10分钟之内就可使钙电流减少3050%。如不加以矫正，则直接影响结果的可靠性，尤其是给药前后的对比，因此在实验设计中，必须考虑到这一因素，并设立严格的对照组。7273（2）T型钙通道: 激活所需的膜电位较低,通常为-100-60 mV。此差别常用来与L型钙通道进行鉴别，如将膜电位钳制在-40 mV时，去极化只能得到L型钙电流，因T型通道已被完全抑制。 当有钠通道和钾通道拮抗剂存在时，膜电位被钳制在-100 mV时，进行不同程度的去极化，所得到的内向电流可分为两种成分，即快速失活的T型钙通道电流和缓慢失活的L型钙通道电流。 T型钙通道对双氢吡啶类钙拮抗剂均不敏感，Cd2+对其抑制也不明显。74（3）N型钙通道则仅存在于神经细胞和突触部位，这种通道激活时，所需的膜电位与T型钙通道相似，范围在-100- 40mV。此型电流不能被二氢吡啶类钙拮抗剂所抑制，但可被较低浓度的Cd2+所阻断。-CTX是其具有相对特异性的拮抗剂。75 钾通道电流的测定 钾通道是亚型最多、分布最广的一大类离子通道，现在已知并具有明确功能及动力学特性的钾通道就有十多种，各种钾通道亚型的特征电流不如钠或钙通道电流明显，因此在研究中要根据它们的电压及时间依赖性，选择恰当的刺激步骤及时间，配合特定工具药进行区分。76（1）内向整流钾电流（IK1），主要参与细胞膜静息电位的形成，并直接影响动作电位的形态。通常保持电位-60mV，阶跃电压从超极化（-120mV）至去极化（+30mV），将各钳制电压末期的电流对膜电位作图，得出电流-电压关系曲线（I-V曲线），其形状为“N”型，反转电位为-70-60mV，主要受细胞外钾的影响。该电流受到抑制时，可使膜电位升高，动作电位延长，尤其是终末相斜率变大。7778（2）延迟整流钾通道电流（IK）是在去极化过程中被缓慢激活的一种外向电流，测定这类钾通道时，去极化时间应保持足够长，有时需12秒。根据对E-4031不同的敏感性，IK主要含有两个电流成分，即快速激活电流成分Ikr和慢激活成分IKS，该电流属于无失活电流。现有的类抗心律失常药均选择性作用于IKr r，筛选有关抑制IKS S的类抗心律失常药物具有重要的理论和实际意义。7980（3）瞬时外向钾通道（IA或Ito）在去极化早期出现的激活与失活均较快的一种外向电流。由于Ito的存在，使动作电位早期快速复极化。Ito常与Ica相互影响，因此只有在阻断Ica时才能准确测定Ito，常用CdC12或钙拮抗剂硝苯吡啶和Verapamil等阻断钙通道 。 膜 电 位 保 持 在 -60mV， 阶 跃 电 压 -40+60mV可见去极化程度与电流强度呈正相关。钾通道阻断剂4-氨基吡啶（4-Ap）可选择性抑制这一外向电流。8182六、膜片钳改良模式及其它研究方法六、膜片钳改良模式及其它研究方法随着膜片钳技术的广泛应用，相继出现了一些与膜片钳技术相结合的其它研究方法，特别是与克隆技术、激光共聚焦技术及RT-PCR等技术结合的方法，有力地推动了离子通道的结构与功能、细胞内钙来源和机制以及通道组分基因表达和功能的研究。8384穿孔膜片钳记录85脑片膜片钳法86盲膜片钳法8788激光共聚焦与膜片钳相结合方法激光共聚焦与膜片钳相结合方法89重组重组DNADNA克隆与膜片钳相结合法克隆与膜片钳相结合法90