2024/9/22读书报告汇报人：李小阳2103年1月4日病毒宏基因组学概述及其应用研究背景宏基因组学简介病毒宏基因组学研究策略与技术路线研究成果与前景展望Here We Go！2024/9/22一大难题virus Avirus Bvirus CBACTERIAvirus D在人类生产生活中，致病的微生物众多，其中病毒性疾病占据大多数，而现有的诊断方法不可能囊括所有的病毒。因此，从宏观上把握致病性病毒的潜在数量种类以及致病机理变得尤为重要。2024/9/22案例1：Electron micrographs of the human fecal sample. (a) Rod-shaped particles negatively stained with potassium phosphotungstate in 2003. (b) Icosahedral (open arrows)and short rod-shaped particles (filled arrow) recently stained with ammonium molybdate, from the second fraction of the sucrose gradient. Scale bars = 50 nm.2013年6月巴西圣保罗阿道夫鲁茨研究所的西尔瓦娜等人利用病毒宏基因组学对人面部潜在微生物进行研究。案例2：2002年Breitbart应用鸟枪测序法（shotgunsequencing）首次对美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114个潜在的新病毒。遗憾的是无法对其进行归类。两个案例病毒宏基因组学何以横空出世四大瓶颈很多病毒缺乏特异的细胞系或者生长过程中观察不到细胞病变(CPE)。用电镜来观察病毒其灵敏性相对较低。血清学反应，高效的特异性抗体很难获得，有的出现交叉反应而影响结果。PCR法必须基于基因序列，对于未知序列的病毒和变异性大的病毒此法难以实施。宏基因组学 宏基因组学研究的对象是特定环境下所有生物遗传物质的总和，它包含了可培养的和不可培养的微生物的基因总和。研究热点：细菌和病毒宏基因组学。宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体,自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体,自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。2024/9/22病毒宏基因组学病毒宏基因组学：宏基因组学的一分支，指研究特定环境中的病毒群落一门学科。应用解释未知病因挖掘新的活性物质分析特定环境中的病毒群落发掘潜在的新的病毒性疾病病毒宏基因组学2005年,Edwards首次提到病毒宏基因组学这一概念，其描述的是环境中的病毒群落噬菌体。2007年,Delwart再次提到病毒宏基因组学这一概念,并对宏基因组学挖掘新病毒的方法进行了阐述；该文侧重于人和动物机体中的真核病毒群落。最早应用宏基因组学理论分析病毒群落的科学家是Breitbart教授，他于2002年应用鸟枪测序法（shotgunsequencing）首次对美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114个潜在的新病毒。2006年，Zhang等应用宏基因组学在人的粪便中发现了大量的植物病毒。2010年，Li等分析了蝙蝠粪便中的病毒群落。该研究发现了大量新的哺乳动物病毒和昆虫病毒。2024/9/22研究策略与技术路线样品的处理遗传物质的分离与富集构建文库宏基因组学文库的筛选序列分析2024/9/22研究策略与技术路线解冻稀释离心过滤消化样品的处理VIS:Very Important Step2024/9/22研究策略与技术路线PCR产物的纯化PCR扩增反转录双链cDNA合成DNARNA遗传物质的分离与富集2024/9/22研究策略与技术路线文库的构建基因组文库部分基因文库基因组cDNA文库：cDNA文库中的外源DNA片段，是互补DNA。cDNA是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的双链cDNA。基因组DNA文库：将生物体的全部基因组用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度的DNA片段，与合适载体体外转化至宿主细胞所获得的阳性菌落。基因文库：某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后，转化至宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体),所有的菌落或噬菌体的集合。2024/9/22基因组文库和部分基因文库的关系文库的构建2024/9/22研究策略与技术路线文库的构建根据宏基因组学文库筛选方法和研究目的的不同，构建宏基因组学文库的载体和方法也各有不同。构建的宏基因组学文库分为载体克隆文库和基于新一代测序技术的加接头的文库。常用构建文库的载体为：大片段插入载体细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC）和粘粒（coamid）载体、表达载体(pBluescriptSK+)、穿梭载体(CosmidpOS700)及普通克隆T载体。2024/9/22研究策略与技术路线载体的制备。高纯度大分子量基因组DNA的提取。高质量大相对分子质量DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离。载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞。重组克隆的挑取和保存。基因组DNA文库的构建程序：连接转化筛选阳性克隆2024/9/22研究策略与技术路线连接目的基因载体载体的种类可装载的外源DNA质粒（plasmid）10kb噬菌体（phage）0-23kb粘粒载体（cosmid）45kb细菌人工染色体BAC100kb酵母人工染色体YAC300kb-1.2Mb虽然载体种类众多，但基于研究的目的基因大小以及相关文献的报道，质粒载体和BAC的选用较为频繁。2024/9/22研究策略与技术路线宿主选择-常用的宿主主要有大肠埃希菌以及链霉菌属或假单胞菌属。转化宿主DH5E.Coli阳性克隆的筛选涂布氨苄抗性平板37倒置培养菌液PCRAGE测序与序列分析：选取大小不等的片段测序，分析测序的结果质量，将测序波峰良好的序列进行载体和引物的去除及拼接。在NCBI数据库中，应用blastn和blastx工具，分别进行核苷酸序列和6框架阅读翻译的氨基酸序列比对。2024/9/22研究策略与技术路线基因组cDNA文库的构建： 第一，细胞总RNA的提取和mRNA分离；第二，第一链cDNA合成；第三，第二链cDNA合成；第四，双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体，并导入宿主中增殖。2024/9/22总RNAOligo(dt)纤维素柱或磁珠分离5AAAAOligo(dt)+reverse transcriptasemRNA5AAAADNA3TTTTRNaseH5AAAADNAploymeraseDANligase3TTTTTdT加尾5AAAA33TTTT55AAAACCCCCCCC5第一步：mRNA的分离。第二步：第一条cDNA链的合成。第三步：第二条cDNA链的合成。第四步：克隆双链cDNA至载体并导入E.coli2024/9/22研究策略与技术路线筛选宏基因组学文库的技术功能性筛选法底物诱导基因表达法稳定性同位素技术筛选法荧光原位杂交技术法能有效的筛选到具有活性的物质和新型抗生素。受限于表达型的宿主菌株、工作量大及效率低。直接测序法序列拼接-拼接的contigs或者单序列通过不同的数据库进行核苷酸和氨基酸的比对-筛选有用的目的信息。罗氏公司454焦磷酸测序技术和Illumina公司推出的Solexa测序技术高通量测序2024/9/22研究成果与前景展望在我国腹泻儿童粪便中首次发现HBoV2、HPeV、Aichivirus、Klassevirus/salivirus和Humancosavirus等新发病毒（单同领，2011）。在美国猪群中发现了kubovirus,sapovirus,sapelvirus,猪肠道病毒9和猪肠道病毒10，星状病毒，Teschovirus，PBoV3,环病毒，新的微小核酸RNA病毒等。其中星状病毒和PBoV3为新的种；环病毒、Rosavirus1和Rosavirus1可能为的新的病毒属或者新的病毒科（单同领，2011）。对患有肠道病毒性肠炎的火鸡群，进行病毒宏基因组学分析，发现了大量的呼肠孤病毒、小病毒、星状病毒等，系统描述了多种病毒共同感染火鸡，导致火鸡生产性能降低的可能性（Day，2010）。对采集北美的蝙蝠粪便进行病毒组学研究，结果发现蝙蝠体内携带的病毒种类十分丰富，不仅含有大量的动物病毒，而且还有植物和昆虫病毒（Li，Donaldson，2010）。应用病毒宏基因组学技术结合高通量测序和生物信息学分析我国腹泻仔猪粪便内的病毒群落，初步鉴定出此次腹泻的主要病因为变异PEDV；分离和鉴定1株变异PEDV（JS-2013），其可作为研发疫苗的候选毒株（单同领，童光志，2013）。前景展望前景展望面临的挑战 运用病毒宏基因组学，已经成功地从多种环境样品中鉴定出多种病毒，使人们了解到不同环境的病毒构成，从而更科学地防制病毒的侵染。 描绘出一些中间宿主的病毒携带情况，这不仅丰富了病毒库，而且增加了对病毒多样性和分布的了解。实时监测一些致病性病毒和潜在致病性病毒的变化情况，并且有助于诊断一些新发的或尚不明病原体的疾病，还可以快速地侦检突发病毒性公共卫生事件。过滤技术高通量测序法病毒宏基因组学数据库1继续进行副猪嗜血杆菌TbpA基因的原核表达与蛋白纯化2学习高级生物化学、分子生物学、PCR技术和DNAstar软件。3阅读与病毒宏基因组相关的文献学习计划2024/9/22谢谢大家！请大家批评指正！